步骤名称

主要操作

确定基因序列

根据实验需求，在NCBI上找到目的基因序列。

选择表达载体

选择合适的载体，常见原核表达载体是pET系列、pGEX-4T-1、pET-SUMO等。

选择表达宿主

BL21（DE3）、Rosetta系列菌株

原核表达质粒的构建

在MCS上选择合适的酶切位点，载体与目的基因用同样的双酶切后，进行胶回收、连接、转化、测序验证。

质粒的克隆与鉴定

首先将质粒分别转化进入DH5α感受态、BL21感受态，然后挑取单克隆菌落，送菌液核酸测序，测序后，使用Snapgene软件比对测序结果。比对结果见附录。及时小提质粒，进行质粒的入库和保存，同时保菌。

重组蛋白的表达和纯化

转化后，按照菌液百分之一的比例接菌，千分之一的比例加入卡那霉素，37℃220 r/min，6小时后，测定吸光度OD₆₀₀ nm值，在0.6～0.8范围内为最佳。

当菌落生长状态达到对数生长期后，根据预实验确定IPTG的合适浓度梯度，加入IPTG，使其终浓度为1.0 mmol/L。37℃ 220 r/min培养6 h后，8000 r/min离心3 min，收集菌体沉淀，并用PBS将沉淀清洗三次。

菌体裂解

接着，菌体沉淀需要经过超声破碎，室温裂解。1 L菌液沉淀用20 mL PBS重悬，破碎菌体，10 W功率下超声1 h后，12000 rpm离心15 min收菌。去上清，将沉淀用lysis buffer重悬，室温裂解2 h。裂解完毕后，12000 rpm离心15 min，留上清，得蛋白裂解液，用0.45 μm滤器过滤。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白表达后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白的表达情况。对比诱导前、诱导后目的条带的表达情况，确认是否成功表达。

目的蛋白的纯化

（根据标签的不同，选择对应的纯化方法即可。）

此时的蛋白裂解液中包含所有蛋白，为了纯化目的蛋白，利用镍离子与His标签结合的特性，选择了Ni-NTA预装重力柱。纯化具体流程描述如下：流出预装液，用二馏水清洗柱子，加入10 mL Binding buffer（5 mM 咪唑的8 M Urea PBS）平衡柱子，调整转速25 r/min，挂蛋白，该操作重复三次；接着用Binding buffer洗杂，洗至溶液Protein A280接近基线时，换用Elution buffer（500 mM 咪唑的8 M Urea PBS）洗脱目的蛋白，保留并记录样品浓度，洗至溶液Protein A280接近基线后，处理柱子，再用5倍柱体积的Binding buffer洗至溶液浓度到达基线，再用二馏水清洗，最后保存于20%乙醇中。注：全程操作柱子不可以流干，否则损坏柱料，影响纯化效果。

测定蛋白浓度，验证