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一文读懂原核蛋白表达

2023-06-14 阅读(377)

一、原核表达概念

蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。原核蛋白表达是指通过基因克隆技术,将外源目的基因,通过构建表达载体并导入表达菌株的方法,使其在特定原核生物或细胞内表达。

 

二、原核蛋白表达系统优缺点

常见的蛋白表达系统有原核、酵母昆虫植物哺乳动物表达系统,其中最经济最实惠的是原核蛋白表达系统,四种常见表达系统区别如下表1:

 

表1:常见蛋白表达系统区别

表达系统

缺点

原核

经济实惠,表达量高

不能进行糖基化修饰,形成包涵体;产生内毒素

酵母

表达量高,有翻译后修饰功能,可大规模表达

缺乏强有力的受严格调控的启动子,分泌效率低

哺乳动物

产品的抗原性、免疫源性与天然蛋白最接近,糖基化准确

产量低

昆虫

糖基化形式较低,表达形式单一

成本高,表达量低

植物

易于大规模培养

转基因植物费用高,表达量难提高,分离纯化不便

 

蛋白表达量:原核>酵母>哺乳,昆虫系统与原核和酵母接近,选择合适的蛋白表达系统还需要根据您的实验成本、周期等一系列因素综合考量,目前最常用的是原核蛋白表达系统,原核表达体系常用的宿主为大肠杆菌和枯草杆菌,前者表达量高,后期产品需要去除内毒素;后者蛋白产量相对较低,但不产生内毒素,主要区别如下表2:

 

项目

大肠杆菌表达宿主

枯草杆菌表达宿主

优点

应用广泛

操作简单

大规模生产

成本低廉

生产成本低廉

不产内毒素

能够分泌表达蛋白

缺点

分泌能力差

产量相对较低

常用宿主

Rosetta(DE3)

Rosetta(DE3)pLysS

Rosetta 2(DE3)pLysS

Origami 2(DE3)

Rosetta-gami 2(DE3)pLysS

WB600

WB800N

Bacillus Subtilis 168

 表2:大肠杆菌和枯草杆菌表达系统比较

 

三、原核蛋白表达系统组成

一个完整的蛋白表达系统通常包括宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。

1、宿主菌

原核蛋白常见宿主菌系列为BL21(DE3)、Rosetta系列菌株。

2、外源基因

由于外源基因具有多样性,高效表达外源基因须考虑优化密码子,提高外源基因 mRNA 的稳定性,优化载体设计等。

3、表达载体

原核蛋白表达载体质粒包括复制子(Replicon)、启动子(promoter)、筛选标签(selection marker)、多克隆位点(MCS)和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy),常见的原核表达载体pET-28a(+)、pGEX-4T-1、pET SUMO,原核表达质粒载体如图所示:

图1:原核蛋白表达质粒载体

4、其他组成(融合标签)

蛋白重组表达过程中采用亲和标签融合表达有两方面的作用:一方面是为了使蛋白纯化过程变得更加容易;另一方面是为了促进某些不溶性蛋白可溶。融合标签选择可参考卡梅德官网列表。

 

四、原核蛋白表达系统应用方向

原核表达系统有非常良好的应用前景。根据查询相关公开信息显示,原核表达系统可以用于大规模生产重组蛋白,如药物、疫苗、抗体等(如CMD-RP00002),从而为生物医学领域提供了有力的支持,原核表达系统可以用于生产植物和动物的生长调节物质、抗菌肽、抗虫蛋白等,从而提高作物产量和品质,降低农药使用量,保障食品安全。同时,原核表达系统也可以用于生产工业酶、生物染料等,具有高效、低成本、环保等优点,为工业生产提供了新的途径。

 

五、卡梅德生物提供原核蛋白表达服务

卡梅德生物致力于为客户提供优质的原核蛋白表达服务,每年提供多达400个原核蛋白制备项目。卡梅德生物(KMD Bioscience)设计了一套有效的包含多种融合标签(His,GST,SUMO,FLAG等标签)的表达载体,能够为客户可溶性表达超过150kDa分子量的重组蛋白;同时我们收集与建立了多种表达菌株(包括低温诱导表达菌株,10-16℃超低温诱导表达蛋白),以保证每一个重组蛋白制备的品质。

 

六、卡梅德生物为客户提供原核蛋白表达全流程介绍

原核蛋白表达大致实验流程图如下: 

图2:原核蛋白表达实验流程图

 

1、优化密码子

大肠杆菌对密码子的使用频率不同,有最佳密码子,偏好密码子,一般选择使用频率大于20%的密码子。基因序列经过优化,能提高mRNA二级结构的稳定性,避免tRNA库数量不充足延迟/终止翻译,翻译移码和氨基酸错配等情况。

2、目的基因合成

通过PCR方法,以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

3、表达载体构建

选择合适的载体,常见原核表达载体是pET系列、pGEX-4T-1、pET-SUMO等,将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳,PCR产物双酶切后回收。

4、转化表达菌株

原核蛋白使用BL21(DE3)、Rosetta系列菌株,将质粒载体在连接酶作用下转化到RosseStta BL21菌株,通过涂布TB(含50ug/ml kana)平板筛选,挑取单克隆进行活化培养。

5、蛋白表达鉴定

从TB平板中挑取单克隆活化培养至菌体OD600为0.6-0.8时,IPTG进行37℃诱导4h表达,取诱导表达前与诱导后各条件的菌体制样进行SDS-PAGE分析,诱导表达结果如图:

 

图3:RosseStta BL21菌株诱导表达 

 

6、蛋白放大表达与纯化

1)放大表达

取能够表达目的蛋白的BL21菌株,接种到1L TB培养基,加入IPTG诱导12h,离心,收集菌泥,超声破碎后收集上清和沉淀,如下图放大诱导表达结果:

 

图4:RosseStta BL21菌株放大诱导表达

 

2)纯化

上清纯化:过滤膜上Ni柱亲和富集纯化,SDS-PAGE分析。

包涵体(沉淀)纯化:缓冲液洗脱上Ni柱亲和富集纯化,SDS-PAGE分析,纯化结果如下图:

 

图5:RosseStta BL21菌株纯化结果

 

7、交付

卡梅德生物交付完整的实验数据报告和测定出浓度的蛋白,以及SDS-PAGE结果图片。 

 

 

经过多年的发展,卡梅德生物科技(KMD Bioscience)建立了一套完整的蛋白表达,蛋白发酵,蛋白小试与中试规模的工艺技术支持。蛋白体外重组表达与制备,通常涉及到表达宿主的选择,基因的合成,载体的构建等技术细节。客户只需要提供我们一段蛋白序列,CDS或蛋白名称,我们富有经验的科学家均可以为您在较短的时间内制定一个完整的蛋白表达和纯化方案。