1. 想要原核蛋白表达顺利，我们需要做那些前期准备？

答：我们可以从网络上的一些数据库来了解蛋白分子量大小、有无信号肽、跨膜结构域、亲疏水性等，预测蛋白的二级结构、三级结构，参考文献调研总结蛋白表达注意事项，分析是否进行融合蛋白表达、是否添加标签等、进行密码子优化。

2. 蛋白表达量低怎么办？

答：在进行大量诱导表达前，最好进行预实验。主要因素包括：诱导剂IPTG的浓度、诱导时间、诱导温度，通过单因素变化的预实验，得出蛋白表达量最高的条件。

3. 可溶性表达不出来怎么办？

答：为了促进蛋白的可溶性表达，可以尝试在目的蛋白的N端或C端添加融合标签，常见的有GST、SUMO标签。但需要根据蛋白的下游应用，判断是否需要进行标签的去除。

4. 出现包涵体表达怎么办？

答：如果蛋白的实际应用不需要有活性，包涵体表达也没关系。但是后续蛋白的纯化过程需要在变性条件下进行。

5. 序列带有亲和标签，但为什么不挂柱？我们该如何处理？

答：常见原因有两种。一是标签短，目标肽链相对较大，标签因被包裹而未暴露，我们可以通过给标签和目的片段中间加个linker的方式来进行改善；二是结构不正确，发生了高度聚集，标签未暴露，第一我们可以改变构建策略，第二是优化缓冲液，让标签充分暴露出来。

6. 蛋白在纯化过程中发生降解该如何改善？

答：我们需要根据降解出现的时间进行对应处理。如果发生在培养过程中，我们需要优化培养条件，可能是营养物质过于丰富等原因，可以通过优化培养基、培养的温度来改善；如果我们排除了是培养过程中发生的降解，那么可能是纯化过程发生了降解，解决办法是加蛋白酶抑制剂、低温处理环境，降低物理剪切力。

7. 原核表达常用载体？

答：pET系列载体的使用在原核中是最常见的，诱导剂为乳糖或IPTG，也属于常见诱导剂类型。pET系列载体的优点是标签形式多样，便于纯化；缺点是高表达，会容易形成包涵体。pGEX-4T-1载体是一种常用的原核表达载体，该载体全序列中含有tac启动子、GST标签序列，可在BL21、Rosstea等表达菌株中高表达融合有GST标签的蛋白，且用凝血酶可将目的蛋白的GST标签切掉，便于下游蛋白纯化。