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荧光原位杂交介绍

2023-11-30 阅读(115)

一.荧光原位杂交原理

 

以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针,探针和靶序列双链DNA变性后杂交,互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA,通过荧光标记的亲和素或抗地高辛抗体将半抗原显示出来,通过荧光显微镜观察杂交信号。

 

二.荧光原位杂交探针类型

 

探针类型

探针简介

双链DNA探针

目前应用广泛,简便易行,不易降解,一旦克隆成功,就可运用相同的扩增和标记程序获得大量的标记探针

单链DNA(ssDNA)探针

稳定,更易于使用,更具特异性对RNase具有抗性,更好的组织渗透性,无自我杂交

RNA探针(核糖体探针)

更高的热稳定性,更好的组织穿透力,特异性更高,RNase的影响更小

合成寡核苷酸

经济、稳定、特异性强,对RNase具有抗性,组织渗透性好,重现性好

 

三.荧光原位杂交样本处理

 

1. 常规石蜡包埋组织切片

新鲜样本取材后经过固定、水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和烘烤制备成常规切片,过程中特别注意固定(固定液类型、固定时间)和切片(载玻片选择、预防脱片、切片厚度)。

(1)固定:常规固定液为4%中性甲醛,凡需要进行病理组织学检查的标本(器官或组织),于离体(活体或尸体)后,应尽快置放(浸泡)于装有足够量固定液的容器中固定。固定不及时,细胞发生自溶,DNA降解,DAPI下观察,标本呈现核很浅,甚至有糜烂现象,信号无或缺失严重;若固定时间太久,大分子交联情况严重,很难进行消化,背景高。如果把握不好固定的时间,对后续结果判读有很大的影响。

(2)切片:一般3~5μm之间,若切片薄,所需消化时间相对短,若消化过度,信号会出现很大比例的丢失,影响结果判读;若切片厚,难于消化,需适度延长消化时间,且易出现细胞堆积层叠情况,细胞界限不清晰,不易单独计数,更易出现高背景,影响结果判读。

2. 常规细胞学样本

(1)低渗:低渗处理凭借反渗透作用使细胞膨胀、染色体铺展,同时可使粘附于染色体的核仁物质散开,以便能在一个平面上观察所有染色体形态。样本需要进行充分低渗,但是避免低渗不足或者过度。低渗是否充分对FISH检测结果影响非常明显,对于低渗不足的样本,后续可以尝试延长消化时间,改善结果,但是对于低渗严重过度的样本,FISH结果几乎不可逆。

(2)预固定:低渗后细胞核膨胀,比较最脆弱,进行预固定时,小心缓慢加入固定液。卡诺氏固定液是常使用的细胞固定液,适用于一般组织和细胞的固定,有极快的渗透力,能迅速穿透细胞,将其固定并维持染色体结构的完整性。

(3)滴片:质量好的细胞滴片应具备:细胞密度及数目适当,分布均匀。密度过高的滴片细胞互相重叠;密度过低的滴片,细胞量少,均难以做出准确的诊断。当遇到标本细胞严重聚集成团,细胞碎屑或杂质过多(可自发荧光,造成强背景)时,则需要低渗前使用胰酶或胶原酶进一步处理(常用于尿脱落细胞、羊水细胞),使细胞分布更均匀,滴片背景更干净。

 

四.荧光原位杂交优势

 

1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定,一次标记后可在一年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列,其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

 

卡梅德生物能够提供包括从探针设计、样本处理、杂交检测、基因表达研究到数据分析等一站式FISH技术服务,实现了检测程序的规范化和标准化,提高了实验结果的准确性,降低了假阳性和假阴性,保证为客户提供高质量的FISH服务。我们的荧光试剂和探针经济安全,短时间内即可完成所需实验,可以帮助客户减少实验室FISH操作的复杂耗时过程,同时降低了实验成本,节约宝贵样本,为客户的科研工作保驾护航。

 

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