荧光原位杂交（FISH）的基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互 补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记 DNA 探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或 DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或 DNA 纤维上的 DNA 序列定位、定性和相对定量。实验方法如下：

一、玻片处理：

（1）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1% 盐酸浸泡 24 h，再在 0.1% 焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡 24 h。

（2）硅化处理：玻片和盖玻片 1%（质量分数）盐酸煮沸 10 min，烘干，锡纸包好 4 ℃ 保存备用。

（3）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中 10 min，然后 60 ℃ 烘干过夜备用。

（4）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用 1 mL/LDEPC（Diethyl Pyrocarbonate）水溶液浸泡处理（37 ℃、2 h，室温过夜），高压消毒去除 DEPC，然后 250 ℃ 烘干 4 h 以上或 200 ℃ 过夜。称量试剂勺也要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒。为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经 0. 5 mL/L DEPC 水溶液处理 3 h 以上，然后再高压灭菌，烘干。若为进口已处理的无 RNase 和 DNase 的枪头、试管可不必处理直接使用。

二、样品制备及其所涉及的试剂包括：

（1）缓冲溶液：

1 × PBS 缓冲溶液：NaCl 8 g，Na2 HPO4 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，溶入 1000 mL 超纯水；

3 × PBS 缓冲溶液：NaCl 24 g，Na2 HPO4 8.7 g，KCl 0.6 g，KH2PO4 0.6 g，溶入 1000 mL 超纯水；

通常配制成 10 × PBS 的储备液，3 × PBS 和 1 × PBS 可用 DEPC 水稀释获得。

（2）4% 多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）

称取 2 g PFA 加入 30 ml 约 60 ℃ 的热水，滴几滴 20% NaOH 放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。然后向其中加入 16.5 ml 3 × PBS 缓冲液，在冰浴中充分混匀冷却，冷却后，用 HCl 调整至中性（7.2 左右），拿出搅拌子。向 PFA 溶液中加入超纯水，定容在 50 ml。用 0.45 微米的膜过滤后使用。（室温或 4 ℃ 保存备用）。

（3）配制 50%，80%，98% 无水乙醇溶液，每个总量 20 mL。

（4）DAPI 溶液

用 1 ml ddH2O 将 DAPI 溶解，制得 2.9 mM 的 DAPI 溶液（1 mg DAPI/1 mL H2O）。（DAPI 不能直接用 PBS 等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解）。取适量 DAPI 水溶液加到 PBS 中，制备成 10～50 µM 的 DAPI 溶液。

（5）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用 1 mL/L DEPC 水配制。

注意：

① 配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因 PFA 有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用。

② 加热时，温度不宜过高，常为 60~65 ℃，否则，PFA 降解失效。

③ 配制好的 PFA 虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，应尽早使用。

④ 4% PFA 是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的 RNA，同时对形态保持也较好。样品固定时间在 2～3 小时。

⑤ RNA 含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。

三、取样及保存方法：

（1）反应器沉淀前取样 2～5 mL 至离心管。

（2）离心 （2000 r/min）5 min，去上清液 （加蒸馏水重复两次）。

（3）样品加入 1 mL 多聚甲醛，摇匀，4 ℃ 下放置 3 h。

（4）样品离心（12000r/min）5 min，去上清夜。

（5）加入 1 × PBS，摇匀，离心（10000r/min）5 min，去上清夜 （重复 3 次）。

（6）加 0.5 mL 1 × PBS，0.5 mL 无水乙醇，摇匀，-20 ℃ 保存 （可保存 6 个月）。

四、样品固定：

稀释样品 3～5 倍，对样品进行超声处理 （3W 超声 2～3 min，沉降 1 min，去沉淀物，5W 超声 5 min），将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜 计数。然后取 3 μL 样品涂于包埋明胶的玻片上 （检查样片本底），37 ℃ 的热烘箱固定 2 h（或者在空气中干燥 2 h 或者过夜）。依次用 50%、80%、98% （质量比）乙醇浸渍 3 min，对细胞进行脱水后，立放，并进行干燥。

五、样品杂交：
实验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液 （Hybridization Buffer, HB）和淋洗缓冲液 （Washing Buffer, WB），其组分如表 1-1 和表 1-2。

（1）吸取 2 mL 杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在 46 ℃ 杂交炉中放置数分钟。
（2）吸取 10 μL 探针贮存液和 80 μL 杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入 46 ℃ 杂交炉中预热数分钟；探针贮存液浓度为 25 ng/μL，用无菌水稀释购买的探针，实验用的探针序列及杂交条件见表 1-3 所示。

注：

（1）表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度（%）。

（2）吸取 9 μL 预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于 46 ℃ 下进行杂交（黑暗中进行），杂交时间为 2～3 h。

（3）杂交后的洗脱：打开恒温水浴槽，加热到 48 ℃，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后，快速放入淋洗缓冲液，48 ℃ 水浴 20 min 后用 4 ℃ 冰水，冲洗样品，样品洁净台中挥干。

六、DAPI 染色：

每孔滴 9 uL DAPI，4 ℃ 暗处 5 min，4 ℃ 冰水（BPS 缓冲溶液）冲洗，挥干。用带有 360 nm 激发波长，460 nm 发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全细胞计数。

七、封片：

涂封片剂，盖盖玻片，无气泡后指甲油封装。

八、荧光显微镜进行检测

每个样品及每个探针都采集 20 个不同区域。每个区域中的细胞个数要超过 1000 个，然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。细菌丰度或细菌数 目（cells/g 或 cells/L）为 AS1/（S2V），其中 A 为视野中细菌平均数；S1 为样品涂抹面积；S2 为视野涂抹面积；V 为样品体积。