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细胞流式检测

2024-01-29 阅读(78)

FACS是纯化已知表型细胞群的一种选择技术。当需要非常高纯度的所需群体时,当目标细胞群体表达非常低水平的鉴定标记时,或者当细胞群体需要基于差异标记密度进行分离时,FACS是优选的方法。此外,FACS是唯一可用的基于内部染色或细胞内蛋白表达(如基因修饰的荧光蛋白标记)分离细胞的纯化技术。FACS允许基于大小、粒度和荧光对单个细胞进行纯化。

 

一.流式细胞仪工作原理

 

流式细胞术的工作原理是使细胞被制备成单个细胞悬浮液,这需要用特异性荧光染色。在照射下收集激光束产生的散射光和激发荧光进行分析。这些的强度荧光信号代表细胞表面抗原的表达水平或细胞内物质的浓度细胞核,它可以转换成电信号经光电倍增管接收后,再转换转换成可被计算机识别的数字信号通过模拟/数字转换器。实现单元格排序通过分离含有单个细胞的液滴。喷嘴流室配备了超高频晶体管。充电后,它振动并打破弹出的液体流成均匀的液滴。待测定的细胞分散在这些带有正电荷或负电荷的液滴中,并在电场中分离。与MACS相比,FACS不仅可以分析细胞的形态特征,如大小和通过前向散射和侧向散射对细胞粒度进行检测,同时检测多个表面标记物,从而更好地定位目标细胞,便于进一步分选。

 

二.细胞流式检测步骤

 

1. 准备起始细胞群体的单细胞悬浮液;

2. 通过大量纯化方法,如补体耗竭或磁性分选,富集所需的细胞群体。浓缩步骤的主要优点是减少了分拣时间;

3. 用染色缓冲液清洗细胞一次;

4. 丢弃上清液,并将细胞重悬于浓度高达50x10^6的染色缓冲液中,以进行有效染色;

5. 对于表达高水平FcR的细胞,使用适当的阻断方法阻断受体。一种选择的方法是使用在冰上结合FcγR 10-15分钟的单克隆抗体;

6. 加入适当的mAb(预定浓度)对所需细胞群进行染色,并在黑暗中在冰上孵育20-30分钟,然后用染色缓冲液洗涤两次;

7. 如果不使用直接缀合的抗体,则使用合适的第二抗体或链霉亲和素缀合物重复步骤6;

8. 洗涤后,将细胞重悬于培养基中,并使用重要染料如台盼蓝测定细胞浓度;

9. 将细胞浓度调整为15-20x10^6/ml。对于形成簇的细胞群,在分选过程中可能会堵塞仪器,请通过滤网过滤细胞;

10. 设置并优化细胞分选机;

11. 使用阴性对照样品和单个阳性对照进行补偿。为了消除两个探测器之间的光谱重叠,需要进行补偿。值得注意的是,补偿并不是万无一失的,它会受到某些标记物染色方式的不利影响,也会受到自发荧光低的细胞荧光的不利影响。自发荧光低会导致暗淡和阴性群体之间的分辨率差;

12. 记录要分类的实验样本,并使用门控工具和子集设置方法来定义感兴趣的群体;

13. 一旦确定了闸门,就可以选择闸门,将其分拣到外部收集管中。根据可用的仪器,一次最多可以对四个门(或种群)进行排序;

14. 在4°C下运行实验样品管,打开偏转板,对样品进行分类。5x10^5-1.5x10^6个细胞可以分选到12x75mm的试管中,1.5x10^6-4.5x10^6个可以分选到15 mL的锥形试管中;

15. 获得所需数量的单元格后,手动停止排序;

16. 进行分选后分析以确定分选细胞群的纯度。

 

三.荧光信号来源

 

对于使用流式细胞术分析和通过分选分离的所需细胞群,需要光信号。这些光有两种类型,一种是与激发光束路径平行或正交的散射光,另一种是作为荧光发射的光。与所有细胞一样,植物原生质体也含有内源性化合物,当受到激发时,这些化合物会发出自身荧光,在较短的激光波长下激发尤为明显。来自绿色组织(空中器官)的原生质体由于叶绿体内的光色素受到激发,显示出高水平的叶绿素自身荧光。

荧光标记的另一种方法是用外源性荧光染料染色,要么是直接反应的物质,要么是可以作为荧光激素类似物被植物吸收的荧光化合物,要么是附着在抗体配体上的荧光化合物,后者广泛用于哺乳动物细胞的流式细胞分析。

 

四.流式分选技术用于核酸适配体筛选

 

FACS是一种灵敏、高通量、自动化的方法,广泛用于细胞与其他亚群细胞的分离,根据不同的光散射特性或转换染料的能力区分活细胞和死细胞。因此,它可以消除死细胞非特异性吸附的影响。此外,通过FACS可以在线监控筛选过程,通过设置分选门可以很好地控制在线筛选的严格程度。FACS辅助SELEX测定可分为两类。第一种方法是将适体与大靶标(如细胞和细菌)结合,直接使用FACS分离和收集结合核酸的大靶标。第二种是适体粒子SELEX (APs-SELEX),它可以使每个适体形成一个适体粒子,该粒子在其表面含有单个适体的许多副本。该方法具有效率高、速度快的优点。此外,它可以消除非特异性适配体的不需要的富集。然而,适配体颗粒的制备非常复杂,为了减少文库的数量,需要使用磁珠进行一轮常规选择。有研究开发了创新的AgFACS-SELEX (AgNP辅助FACS SELEX)方法,消除了预富集,减少了选择的次数。该方法有以下优点:首先发现AgNP可以增强Cy5的荧光强度,AgNPCy5可以与文库杂交选择非自杂交文库,显著提高了筛选效率,减少了选择次数。荧光增强的机制可以在我们之前的报道中找到。其次,每一轮选拔都可以被FACS在线监控。通过设置分选门,可以回收和丰富所选库的高亲和力。最后,该方法选择不需要预先富集文库和制备适体颗粒。此外,基于纳米颗粒的筛选信号放大尚未见FACS-SELEX的报道。

 

卡梅德生物能够为客户提供包括悬浮细胞(例如:B细胞)、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液、血液、各种体液和其他生物颗粒(例如:胞内细胞因子)的流式细胞检测服务,还可以提供用于单B细胞筛选技术的单B细胞分离和分选,并且可以对胞内的DNA、RNA、蛋白质及细胞表面抗原等多种参数进行分析。