稳健的生产工艺可实现一致的糖基化，这对于生物制药的功效和安全性至关重要。有关糖基化的信息可以通过传统的自下而上的方法获得，但通常仅限于聚糖或糖肽水平。在这里，我们应用高分辨率天然质谱（MS）来表征治疗性融合蛋白依那西普，以揭示迄今为止无与伦比的质谱复杂性条件下的糖型异质性。低电荷态下更高的空间分辨率是非变性MS的固有特征，是成功揭示聚糖异质性的关键组成部分。结合使用一组蛋白酶和糖苷酶的酶解剖，通过将信息从亚基转移到整个蛋白质水平来实现特定糖型的分配。完整依那西普的天然质谱分析作为评估批次间变异性的指纹图谱工具的应用是例证，并且可以扩展以证明生物制造过程变化后的可比性。

生物制药的批准需要在分子水平上进行深入表征，包括确认氨基酸序列以及全面评估翻译后修饰（PTM）。一致的糖基化是一个重要的质量属性，因为它可能会影响治疗产品的疗效和安全性。当前的分析方法包括对游离寡糖或糖肽的表征，提供有关平均分子组成的详细信息。或者可以通过测定完整的蛋白质质量数来揭示特定蛋白质型的存在和相对丰度，正如几种治疗性单克隆抗体 （mAb） 所实现的那样。变性条件下的常规质量数测定仅限于复杂性有限的样品，因为针对各个电荷态观察到的宽信号簇重叠。相反，在天然质谱（MS）中应用的条件下，蛋白质折叠得以保留，导致在相应质谱中位于较高m / z处的较低电荷态。在高m/z下固有的更高空间分辨率允许分离，从而对这些宽信号簇进行反卷积。该技术已用于表征非共价蛋白质复合物，例如大型蛋白质组装体或抗体-药物偶联物。非变性MS也已应用于mAb复合混合物的定性和半定量分析以及表征由N-糖基化变体等引起的治疗性蛋白质中的微异质性。在这种情况下，通过整合非变性MS测定完整蛋白质质量数、蛋白水解糖肽的中向下分析和酶促去糖基化，成功揭示了人促红细胞生成素（26–30 kDa）和人血浆前蛋白（54 kDa）的聚糖异质性，这有助于将PTM组成分配给检测到的完整蛋白质质量数。

依那西普是Enbrel的活性药物成分，是一种高度糖基化的治疗性Fc融合蛋白。这种生物制药可作为肿瘤坏死因子（TNF）的抑制剂，TNF是炎症细胞反应的重要介质蛋白，并已被批准用于治疗类风湿和银屑病关节炎等自身免疫性疾病。依那西普由与人IgG1的Fc部分融合的TNF-α受体（TNFR）结构域组成，并形成由三个分子间二硫键稳定的二聚体，导致理论蛋白质质量为102.4 kDa).所得蛋白质包含多个糖基化位点：二聚体TNFR结构域中的四个N-和26个O-糖基化位点，以及Fc结构域中的两个N-糖基化位点，如先前通过亲水作用液相色谱和荧光检测分析释放的N-和O-糖分析所表征的那样。在同一项研究中，通过HPLC-MS分析O-糖肽，并具有碰撞诱导和电子转移解离。发现O-聚糖主要由核心1亚型（Galβ1-3GalNAc-）取代，被多达两个唾液酸残基（N-乙酰神经氨酸，Neu5Ac）取代。

我们报告了天然MS在分离130 kDa治疗性Fc融合蛋白依那西普的高度复杂的糖基化模式中的适用性。扩展以前对较小蛋白质的工作我们利用在天然条件下可检测到的较低电荷态的蛋白质亚型的卓越空间分辨率，以发现糖型并探索大于100 kDa的糖蛋白的质谱分辨率和质量精度的极限。为了降低光谱复杂性，从而促进糖型和其他蛋白型的注释，我们采用使用特定蛋白酶和糖苷酶的酶解。我们的方法有助于提供不同分子复杂性水平下N-和O-糖基化模式的全面信息。我们还证明，通过应用先进的计算工具，可以在较低结构水平（即糖肽，蛋白质亚基）上成功整合获得的分子信息，以促进较高结构水平（即部分去糖基化的全蛋白）的糖型注释。因此，在整个蛋白质水平上获得的分子量信息使我们能够提出最可能的聚糖结构组合。最后，依那西普的天然MS可作为快速指纹识别工具，用于评估完整蛋白质水平的批次间变异性。

具体详情，请点击链接：Native mass spectrometry combined with enzymatic dissection unravels glycoform heterogeneity of biopharmaceuticals | Nature Communications