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噬菌体展示技术制备单克隆抗体

2023-11-24 阅读(109)

噬菌体展示技术最早是在1985年发明的,用于展示多肽,后来,在1990年,第一个抗体片段被展示在噬菌体上。从那时起,该技术已被成功地用于发现数百种用于研究、诊断和治疗的抗体,其中包括超过14种临床批准的抗体。噬菌体展示方法的各个方面都得到了改进和进步,从而能够发现针对具有挑战性靶点的抗体和具有一定结合特性的抗体。与其他展示技术(如核糖体、酵母或哺乳、动物展示)相比,噬菌体展示的优点之一是可以创建大型文库并存储以备选择,这使得针对各种抗原发现高亲和力抗体成为可能。

 

1. 噬菌体展示库中使用的抗体

 

噬菌体展示文库可以使用不同的噬菌体来设计,例如丝状的M13、fd和f1噬菌体,以展示各种不同的抗体格式。两种最常用的格式是单链可变片段(ScFvs)和抗原结合片段。其他抗体格式也被用于构建抗体噬菌体展示库,包括人单域抗体(human VH)和骆驼和鲨鱼单域抗体(分别为VHH和VNAR)。VHHs很小(12-15kDa),由仅重链抗体的抗原结合片段组成。与常规抗体相比,VHH中的互补决定区3(CDR3)环通常被拉长,这使得VHH能够结合抗原,例如酶的催化裂口或受体结构域。VNAR片段在大小上与VHH抗体片段相似,但明显的例外是,由于Fr2-CDR2区域的大部分缺失,它们只有两个CDR环。选择哪一种抗体格式进行噬菌体展示活动取决于所发现抗体的最终应用。如果应用是治疗性的并且半衰期很长,scFv或Fab库可能是最佳选择,因为它们可以很容易地重新格式化为常用的治疗用IgG格式。对于研究试剂和诊断应用,或者当大规模生产的成本是一个主要问题时,像VHH这样的格式可能是最理想的,综上所述,描述最终抗体产品的要求以选择最合适的文库类型至关重要。

 

2. 抗原呈递策略

 

对于一个成功的基于噬菌体展示的抗体发现项目来说,所包含抗原的构象与抗原在最终应用中的构象相似是至关重要的。否则,发现的抗体最终可能只能识别改变构象的抗原。因此,噬菌体展示活动的初始和关键步骤是确定抗原呈递的最佳策略。最广泛使用的抗原呈递策略是直接或间接将抗原固定在表面上。在直接固定化中,使用被动吸附将抗原包被在表面上。这种策略是目前为止抗原呈递最简单的;然而,对于许多类型的抗原在吸附时改变其天然构象,这种策略就不太适合了。对于可能没有表现出足够的分子间吸引力来进行被动吸附的小抗原来说,问题可能更大。对于其中的一些抗原,可以使用间接固定化来代替直接固定化。

通过间接固定化,利用捕获分子将抗原捕获在表面。最流行的技术是利用链霉亲和素/中和素与生物素之间的强结合,即用链霉亲和素/中和素包裹表面,抗原通过连接物或标签与生物素偶联。这使得抗原能够间接地、稳定地附着在表面。通过间接固定,抗原更有可能保持其天然构象,然而,至关重要的是不要使抗原过度生物素化,因为这可能会掩盖重要的表位或导致抗原聚集。存在两种不同的生物素化策略:位点特异性生物素化或随机生物素化。位点特异性生物素化可以使用生物素化受体肽(BAPs)包括酶生物素化位点来实现。AviTag是应用最广泛的BAPs之一,它需要重组表达融合到15个氨基酸肽标签的靶抗原。Av32iTag序列的赖氨酸残基被大肠杆菌生物素连接酶BirA生物素化。av33itagated抗原可以与BirA在细菌细胞、酵母和哺乳动物细胞中共表达,以实现体内生物素化。或者纯化的Avi标记抗原可以与纯化的BirA和生物素孵育,以实现体外生物素化。利用BAPs进行生物素化导致每个抗原在特定位点添加单个生物素,从而控制抗原与生物素的比例,避免过度生物素化。然而,不可能在所有情况下使用AviTag系统,特别是当重组表达目标抗原困难/不实际时,或者当AviTag会干扰抗原的潜在重要(末端)表位时。

作为BAP生物素化的替代方案,可以使用随机化学生物素化。在这种方法中,纯化的抗原和生物素化试剂,使用多种可能的反应化学物质,混合在一起,实现抗原和生物素之间的共价连锁。有多种连接物可用,使得在伯胺(赖氨酸残基的N端或侧链)或巯基和羧基上对抗原进行生物素化成为可能。虽然比酶法生物素化(通过大肠杆菌生物素连接酶)更快、更便宜,但化学生物素化需要滴定才能达到所需的1:1抗原与生物素的比例。根据不同的肽标签和标签特异性捕获分子,也可以使用抗原的间接固定化。这就需要抗原在融合中进行重组表达,用肽标签和选择表面涂覆融合标签特异性捕获分子。标签和捕获分子之间的结合导致抗原的固定化。虽然不如生物素-链亲和素系统流行,但his标签和抗his抗体或其他his捕获分子已被用于噬菌体展示选择中的抗原呈递。近年来,一种被称为SpyTag/SpyCatcher的肽-蛋白配体从化脓性链球菌的纤维连接蛋白结合蛋白中分离出来,被用于噬菌体展示选择中的抗原呈递。Spy-Tag和SpyCatcher之间的结合是通过一个异肽键发生的,并且据报道是不可逆的,特异性的,并且对各种条件(如pH,温度和缓冲液)都有很强的适应性。

 

3. 噬菌体文库的应用

 

噬菌体展示抗体文库被广泛应用于高亲和力抗体的筛选工作,如血管生成标志物纤连蛋白,肿瘤特异性B3/B4抗原,EGFR等蛋白特异性高亲和力抗体的筛选。通过噬菌体展示技术构建的抗体文库通常来源于RT-PCR扩增外周血单核细胞,脾细胞,骨髓细胞和扁桃体来源的mRNAs形成cDNA片段,将这些基因片段拼接到噬粒载体,再转入噬菌体形成共价结构蛋白表达和体外展示。抗体重链和轻链独立自由表达,然后随机地组合,形成噬菌体克隆数达到10^11-10^12的庞大抗体库。

 

梅德生物建立了一个完善的、成熟的噬菌体抗体展示技术平台。基于噬菌体展示技术平台,卡梅德生物可以提供包括抗原设计、羊驼免疫、文库构建与筛选、活性功能验证等主要实验环节,并为全球的科学家提供高特异性和高亲和力的羊驼VHH抗体。此外,卡梅德生物拥有丰富的抗体工程构造经验,能够进行立体化的抗体上下游服务,包括抗体人源化服务、人源scFV抗体库构建服务、人源Fab抗体文库构建服务、人源抗体噬菌体文库制备服务以及磷酸化抗体定制服务、抗体亲和力成熟服务等,满足不同客户的科研要求。

 

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