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浅谈蛋白质互作及pull down实验

2024-01-25 阅读(100)

蛋白质互作就是为了验证蛋白质-蛋白质之间是否可以相互作用,通常它们被理解为在活体细胞中或体外发生的蛋白质分子之间的物理接触。在核糖体或基底转录装置中的任何蛋白质都与复合物中的其他蛋白质共享功能性接触,既然有那么多蛋白相互接触,那么特定复合物中的所有蛋白质都是相互作用的吗,答案肯定不是,生物体中基因、蛋白质、代谢物等之间存在许多其他类型的功能联系。而且,它们的关系错综复杂。为了研究这些功能联系,需要不同的实验技术来寻找这种特定类型的关系,例如,双突变合成致死率来寻找遗传相互作用或转录组表达谱来寻找基因共表达,为了鉴定蛋白质与其他物质的相互作用,如:蛋白质与DNA之间的关系、蛋白质与RNA的关系、蛋白质与多肽的关系或蛋白质与配体的关系等等,都需要可以在体外直接操作,且直观、灵敏、快速的方法,Pull down作为研究蛋白之间的相互作用的实验技术之一,就显得尤为重要。

Pull down实验的原理是利用带有标签的蛋白去吸引能与其化做的蛋白,从而验证他们之间的关系以及亲和力。Pull down实验的流程是:首先,裂解样品得到蛋白混合液,其次,将已知的蛋白与标签连接,构建载体将融合蛋白以重组蛋白的形式表达出来,获得带有融合标签的“诱饵蛋白”。其次,将混合蛋白和融合蛋白孵育,为了能够捕获目的蛋白,需要将“诱饵蛋白”亲和固化在与标签对应的亲和树脂或磁珠上,只有这样当目的蛋白与“诱饵蛋白”接触时,“诱饵蛋白”才能将目的蛋白下拉并与之结合在一起形成蛋白复合物,最后,复合物经过多次洗脱后,可以通过蛋白凝胶电泳和WB、LC-MS/MS分析鉴定两种蛋白间的相互作用,或者筛选出相应的目的蛋白。实验中常用的标签有GST、组氨酸、麦芽糖结合蛋白等,其中最常用的就是GST标签,即谷胱甘肽巯基转移酶。

Pull down实验的用途十分广泛,可以根据不同的实验目的进行实验,如为了在体外研究DNA与蛋白的互作关系,有DNA pull-down实验;DNA与蛋白的互作关系有RNA pull-down实验。

卡梅德生物能够提供专业的Pull down实验服务,客户只需要提供实验样本和目的基因的序列信息,卡梅德负责方案设计、实验和分析,最终提供针对客户项目的完整实验分析报告。