自1975年以来，单克隆抗体已被成功地应用于各种疾病的诊断和治疗。例如，嵌合抗体，人源化抗体，以及全人类抗体和小型化的基因工程抗体，已经显示出不断扩大的应用前景。然而，在大多数情况下，较小尺寸的抗体不稳定，导致多聚体（特别是单链可变片段，scFv），较低的亲和力结合，以及大规模生产的问题。

Nb是羊驼外周血中自然去除轻链的抗体。Nb的获得首先需要选择一只骆驼动物进行免疫，这可能需要5-10周的时间。如图1A-F所示，通过提取免疫骆驼的外周淋巴血，从血浆中获得效应B细胞，然后从效应B细胞中提取总RNA，通过反转录PCR技术获得该片段的cDNA序列，因此初级PCR产物可以作为模板进行扩增。之后采用噬菌体展示法进行筛选，从纳米抗体库中富集具有特异性结合能力的Nb-噬菌体，随后建立噬菌体载体的结构。最后，建立Nb表达系统来表达蛋白质并进行功能验证。虽然制备过程相对复杂，但随着噬菌体展示技术等分子生物学技术的发展，Nb的筛选步骤正在逐步优化。

图1 纳米抗体生成示意图

与传统抗体IgG相比，其包含一个重链可变区VHH与两个传统CH2和CH3恒定域相连，其分子量仅为传统抗体的一半。抗体仅含有一个重链可变区，命名为Nb或单域抗体(sdAb)，与初始重链抗体(HcAb)相比，具有相同的稳定性和优异的抗原结合活力。由于其特异性高、稳定性强、亲和力强，在抗体领域取得了非凡的成就。可以毫不夸张地说，Nb在生化机制、结构生物学、肿瘤等疾病的诊断和治疗等方面有着广泛的应用。

纳米抗体作为肿瘤治疗剂

传统抗体在肿瘤诊疗领域发挥了巨大作用，开启了靶向治疗时代。在传统抗体包含 Fc 结构域的条件下，癌细胞可以被抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 和补体依赖性细胞毒性 (CDC) 杀死。然而，传统抗体的分子量高达 150 kb，且其穿透能力较差，因此有时难以到达目标组织。相对而言，Nb的分子量较小，因此很容易穿透屏障到达癌组织。目前，根据Nb的上述特点，针对不同肿瘤（B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性胶质瘤、结肠癌、肝癌、乳腺癌等）开发了Nb药物。广泛涉及肿瘤示踪诊断、直接靶向治疗、治疗载体等。

靶向经典肿瘤相关受体的纳米抗体

Nb因其独特的药理和理化性质可作为治疗人类疾病的新一代药物。Nb 能够有效地耦合到蛋白质外观上的凹面。此外，Nb 具有在细胞中发挥作用以靶向细胞内抗原的能力。Nb在极端情况下具有很强的稳定性，可以通过血脑屏障。由于其对胃蛋白酶不敏感，口服可用于增强胃功能和改善胃肠道疾病。此外，Nb 可以很容易地设计用于新开发特定和有效治疗某些疾病（例如轮状病毒感染）的方法。迄今为止，除了在微生物感染、治疗神经退行性疾病、抗炎和免疫调节方面的应用外，Nb在肿瘤诊治方面的研究成果尤为突出。

EGFR（表皮生长因子受体）在几乎大多数肿瘤中高度表达，并且通过 20 年在人类恶性肿瘤中的努力，已经在治疗药物上产生了单克隆抗体以靶向 EGFR。

癌胚抗原（CEA）在上皮来源的癌细胞中高表达，但在正常细胞中不表达或低表达。此外，在正常结肠组织中，CEA 仅在管腔上皮上表达，IgG 抗体无法穿透该上皮。52 CEA Nb与β-内酰胺酶融合，将β-内酰胺酶定位于肿瘤内部，通过催化β-内酰胺类抗肿瘤前药产生细胞毒药物，原位杀伤肿瘤。这种依赖抗体的酶前药治疗系统可以导致特异性移植肿瘤的衰退或治愈，对肿瘤治疗具有很强的靶向性。

粘蛋白1（MUC1）不仅在多种肿瘤组织中过度表达，而且糖基化在正常条件下不能完全暴露隐藏的表位，已成为免疫诊断和治疗的靶点。

缺氧诱导因子-1 α (HIF-1α) 是调节内体氧稳态的关键转录因子。通过下游靶基因调控血管生成和糖代谢，促进肿瘤细胞的增殖和转移。

除了以上常见的肿瘤靶点，其他新靶点也为 Nb 疗法提供了基础。

尽管 Nb 在肿瘤治疗方面取得了令人振奋的进展，但 Nb 药物的药代动力学、靶向作用和免疫原性还需要进一步优化。

纳米抗体作为靶向配体用于肿瘤药物递送

 在靶向纳米药物递送系统的设计中，抗体-药物偶联物（ADCs）与纳米颗粒（NPs）表面偶联或直接与药物分子偶联，可以实现传统抗癌药物的靶向给药。 ADCs 是一种在临床实践中备受关注的靶向药物设计概念。与叶酸、RGD（Arg-Gly-Asp）三肽等小分子配体相比，抗体最突出的优势是抗体-抗原结合的优异靶向性能。在肿瘤临床治疗中降低毒副作用、克服多药耐药等巨大优势，使得抗体药物在临床治疗中的研究和应用具有广阔的前景。

传统的小分子抗癌药物往往因副作用和耐药性等原因限制了临床应用。纳米药物递送系统（nanoDDS）的概念反映了药物递送方法的新设计理念。将小分子化疗药物嵌入纳米级药物载体，不仅可以解决疏水性药物溶解性问题、血液循环过程中药物易去除的问题，以及难治药物在治疗靶点的堆积问题。此外，还可以准备综合诊疗系统、多药协同转运系统、化疗联合光热疗法或化疗联合其他手段的复杂系统。

虽然Nb没有Fc效应子，也不会像传统抗体那样产生ADCC等细胞毒作用，但由于其特异性高，组织穿透力强，可作为包裹细胞毒药物的脂质体或纳米粒子上的靶向部分，增强对肿瘤的杀伤作用。例如，VEGFR2 Nb 相关的铜绿假单胞菌外毒素具有较好的抗肿瘤作用和主要组织相容性复合物-II (MHC-II) Nb 相关的微管聚合抑制剂 DM1 也具有良好的治疗效果。

因此，Nb 可以作为一种药物传递系统发挥重要作用。可以利用多功能纳米抗体库的大规模生产的特异性将密封的药物输送到作用部位。这种方法可以避免普通给药引起的全身毒性，并使疏水性药物在亲水结构中运输。此外，可以通过这种方式进行大剂量给药，这些掺入Nb的给药系统可以保护药物免受氧化还原和酶促反应，从而避免多次给药产生的免疫原性。再加上其他药物的作用和 Nb 本身可以抑制肿瘤生长，相当于 Nb 的双重作用。

纳米抗体修饰的 CAR-T 疗法

 Nb 不仅可以控制抗肿瘤功能、药物载体系统或放射性核素治疗，还可以调节巨噬细胞，巨噬细胞长期以来被认为是重要的免疫效应细胞。细胞因子是一种具有广阔发展前景的分子，可刺激先天免疫和获得性免疫的自然杀伤细胞，用于抗肿瘤免疫治疗。

与传统抗体相比，Nb在构建CAR-T细胞的过程中更具优势。目前，CAR 中识别的抗原结合位点大多是基于 scFv 设计的（图 6A)，具有高免疫原性。Nb可以降低这种免疫原性。以Nb作为连接或靶向部分获得的CAR-T细胞也是避免肿瘤逃逸的有效途径之一。同时，发现基于Nb的CAR-T可以充分发挥其T细胞免疫治疗的优势，例如导致肿瘤侵袭和转移，诱导炎症细胞因子的释放和细胞毒作用。在Nb治疗方面，在体积小、免疫原性降低、相关肿瘤抗原特异性强等方面也具有相对比较优势。例如，CAR 靶向黑色素细胞分化抗原 gp100 Nb 可以抑制体内黑色素瘤的发展。

然而，CAR-T细胞并不擅长治疗实体瘤，因为很难找到可以作为实体癌安全靶点的肿瘤特异性蛋白。鉴于目前 CAR-T 细胞治疗尚未外推到实体恶性肿瘤的情况，研究人员计划根据 Nb 的特性解决这个问题，这可以推进 CAR-T 细胞技术治疗癌症。Nb 的独特特性之一是它增强了携带显像剂的靶向能力，因此可以准确地观察转移性肿瘤。

总结

噬菌体展示技术的优化将促进Nb文库的构建和特异性Nb的筛选。人源化Nb的改进将进一步降低Nb的免疫原性，提高安全性和有效性。其强大的组织穿透力将有助于实体瘤的干预和治疗，尤其是局部微环境。携带放射性核素、毒素或化疗药物的186纳米载体将为肿瘤患者提供更多治疗。基于Nb的CAR-T或TAC-T将成为传统CAR-T的替代品。总之，Nb 将在替代传统靶向抗体药物、ADC 药物、融合蛋白、局部肿瘤干预治疗和口服抗体治疗方面取得突破。

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