虽然引物编辑能够在 DNA 中实现精确的序列变化，但引物编辑的细胞决定因素仍然知之甚少。使用汇集的 CRISPRi 筛选，我们发现 DNA 错配修复 (MMR) 阻碍了主要编辑并促进了不需要的 indel 副产物。我们开发了 PE4 和 PE5 引物编辑系统，其中与 PE2 和 PE3 系统相比，工程化 MMR 抑制蛋白的瞬时表达将替换、小插入和小缺失引物编辑的效率提高了平均 7.7 倍和 2.0 倍，分别，同时在 MMR 熟练的细胞类型中将编辑/插入删除比率提高了 3.4 倍。在预期编辑附近战略性地安装沉默突变可以通过规避 MMR 来增强主要编辑结果。Prime 编辑器蛋白质优化产生了 PEmax 架构，将编辑效率提高了 2。在 HeLa 细胞中平均为 8 倍。这些发现丰富了我们对主要编辑的理解，并建立了主要编辑系统，该系统在 7 种哺乳动物细胞类型的 191 次编辑中显示出实质性改进。

使用汇集的 CRISPRi 筛选，我们发现 MMR 活动强烈抑制了替代主要编辑的效率和结果纯度。这些见解为共表达 MLH1dn 的 PE4 和 PE5 系统的开发提供了信息，以瞬时抑制 MMR，增强主要编辑效率，并减少插入缺失而不引起大量脱靶基因组变化。对主要编辑器蛋白的优化产生了一种 PEmax 架构，可以与 PE4 和 PE5 系统以及 epegRNA 协同工作。以进一步提高主要编辑性能。总之，这些发现支持的引物编辑 DNA 修复模型、为规避引物编辑瓶颈而开发的 PE4 和 PE5 策略以及此处描述的改进的 PEmax 引物编辑器架构大大推进了引物编辑在基因组精确操作中的效用。

PE4 和 PE5 在 191 种不同的主要编辑中的广泛表征表明，由于相应的主要编辑中间体能够规避 MMR，主要编辑可以更高效地安装某些类型的编辑。除了编辑类型之外，其他属性也可能影响主要编辑对 MMR 的敏感性，例如目标站点的序列上下文。此外，MMR 更有效地修复早期复制的常染色质和复制过程中的滞后链 DNA 。需要对更大的编辑集进行系统研究，以全面阐明这些编辑类型、序列上下文和位点状态对 MMR 和主要编辑的依赖性。Repair-seq 将来也可能用于阐明其他类型的主要编辑，例如长插入或删除，并建议其他改进的主要编辑系统。

我们对 MMR 修复的主要编辑中间体类型的研究使研究人员能够设计主要编辑实验来逃避 MMR，即使没有 MLH1dn 的表达。我们表明，战略性地安装额外的附近沉默突变可以通过避免主要编辑中间体的 MMR 逆转来增强主要编辑结果。MMR 抑制的其他方式也可能证明有利于主要编辑。虽然没有报道选择性靶向 MMR 的小分子，但化学抑制剂在受 MLH1dn 传递限制的应用中很有用。对于维持长期主要编辑器表达的病毒递送等用途，RNA 干扰可能提供一种替代方法来瞬时抑制 MMR 活性。

PE4 和 PE5 系统通过 PEmax 和 epegRNA 的改进，在经过测试的七种哺乳动物细胞类型中强大地增强了主要编辑性能和精确度。带有 epegRNA 的 PE4max 以独特的方式实现高效的引物编辑，插入/缺失副产物少，特别是在具有活性 MMR 的细胞中，使其最适合需要高结果纯度或不能使用切口 sgRNA 的基因编辑应用。相比之下，与 PE3 系统相比，带有 epegRNA 的 PE5max 实现了最高水平的引物编辑，同时减少了插入缺失结果。因此，我们建议在大多数主要编辑应用程序中使用 PE5max 和 epegRNA。原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)01065-5

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