1、对于合成高难度的基因，需要如何解决的？

高低GC，重复结构	使用像酶切链接、多段重组等方式，分成小段，来降低结构对合成的影响。
序列较长	使用多端重组的方式来构建，体外组装与体内组装相结合。
特殊载体元件（如CCDB等）	根据不同的特殊元件更换相对应的特定感受态细胞。
其他不可预测的难度（如有毒性）	尝试不同的感受态细胞

2、在大肠杆菌表达系统中，哪种终止密码子具有偏好性？

在大肠杆菌中，使用频率是：TAA > TGA，TAG很少用。

在哺乳动物中，使用频率是：TGA > TAA > TAG。

密码子偏好性是指不同的生物，对简并密码子使用频率不相同。

密码子优化是一种通过增加靶基因的翻译效率来提高生物体内蛋白质表达水平的技术。通常会通过避免稀有密码子，利用偏爱密码子，简化mRNA的二级结构，优化重复序列，消除限制酶切位点，调整GC含量等方法重新设计基因，以提高翻译效率，进而提高蛋白表达水平。

通常情况下，CAI < 0.80被认为需要进行密码子优化。

1980年代后期，科学家根据高表达基因的参考文献中的密码子使用频率创建了密码子适应指数CAI。

酶切验证是一种验证质粒是否正确的手段，验证时的酶切位点优先选择首位位点；优先选择双酶切，并且两条带的大小不一样；当出现片段太小导致电泳图不明显，或者分离的条带距离太近，不容易分开情况时，选择最能表现质粒本身特征的其他位点。

每三个碱基表达一个氨基酸，移码现象是由于基因中增加或减少非三及三的倍数个碱基，会使得该位点后面的DNA序列产生移码现象，导致表达出来的蛋白非目的蛋白。我们在设计方案时应注意：

a. 酶切位点的选择，如NcoI(CCATGG)，因为其含有一个起始密码子，所以很容易发生移码现象，因此，在使用这类酶切位点时应慎重，可以添加移码保护碱基；

b. 尽量利用载体上已有的序列。

对于大载体、低拷贝载体、背景不清的载体、自杀性载体和特殊抗性载体，很难进行亚克隆。例如：pMG36e（红霉素抗性）和pCYT（氯霉素抗性）等。

合成的成功概率主要由DNA结构（重复序列、GC含量等因素）和宿主细胞稳定性（毒性等因素）来决定。想要提高重组基因合成的成功概率需要考虑以下因素。

主要因素包括：

a. 整体GC含量过低（低于20％）或过高（高于80％）；

b. DNA序列中的各种GC含量；

c. 均聚物（如polyA)；

d. 重复序列长度≥20bp；

e. 小重复序列的个数以及长度；

f.是否含有回文序列；

甲基化现象是DNA化学修饰的一种形式，是一种表观遗传修饰，在不改变DNA序列的情况下，改变遗传表现。

-- 基因COA文件

-- 5µg冻干质粒DNA

-- 质粒结构图

-- 测序图谱