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酵母双杂交服务(一)

2023-11-24 阅读(144)

 

酵母双杂交系统是一种在酵母这种真核生物模型中执行的实验方法,用于探索活细胞内部蛋白质间的相互作用。这种技术能够敏感地捕捉蛋白质间的细微和短暂相互作用,通过检测报告基因的表达产物来实现。作为一种高度灵敏的技术,酵母双杂交系统被广泛应用于研究哺乳动物和高等植物基因组编码的蛋白质之间的交互作用,这一点已被众多研究文献所证实。

 

酵母文库的构建流程

 

为了探索特定蛋白质与其它蛋白质的交互作用,科学家们开发了酵母文库技术。这种“文库”实际上是一个包含了所有基因的庞大数据库。在这个过程中,首先从目标物种提取总RNA,然后从中分离出mRNA。随后,这些mRNA通过逆转录过程转换成cDNA。接下来,将这些cDNA与激活域(AD)载体连接,构建出一个AD文库。将此文库引入到酵母细胞中后,理论上这些酵母细胞就能够表达目标物种的全部蛋白质,从而便于研究它们之间的相互作用。

 

图1 酵母文库构建流程

 

酵母文库的构建方法

 

酵母文库的构建方法主要有两种:SMART(Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)扩增技术和Gateway重组技术,选哪种方法建库,主要看起始RNA量。

SMART技术:即RNA模板5'末端转换机制,可以连续合成5'非翻译区的序列,包含了更大比例的全长克隆。SMART技术,指的是合成的cDNA和线性化的载体共同转化酵母,在体内重组酶的作用下cDNA和载体相连形成完整的质粒。通过SMART技术构建的cDNA文库能够代表原有样品中的mRNA的丰度,保存了生物遗传信息的完整性。

Gateway技术:利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中,可应用于大片段的基因克隆,并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。建库过程中不经PCR扩增,所以要求起始RNA量高,需达到300 μg以上。在样本量充足条件下,Gateway法酵母文库,避免了PCR扩增对文库的影响,如低丰度基因丢失和扩增过程中可能产生的个别碱基突变。

我司目前主要使用Gateway重组技术进行酵母文库构建。它们的区别如表二所示:Invitrogen体系,采用Gateway位点特异性重组技术(Invitrogen专利)构建文库。

  

图2 Gateway技术的原理图

图3 酵母建库方法比较

 

建库材料的选择:

 

目前我们公司酵母建库材料可以选择动物组织、贴壁/悬浮细胞、种子和植物组织等样品。客户需提供至少能提取500μg总RNA的新鲜样本,具体要求如表一所示:

注:对于样品,客户可根据自己的实验目的选取材料的部位和时期,可以是某一时期的某一部位样品,也可以是某一时期的整个植株样品,具体需要依据实验目的而定;一般不同处理条件下的材料需要分别建库,如果客户要求混合建库也是可以的。

 

酵母文库交付标准:

 

1、原始文库容量大于1*10^7 CFU;

2、平均插入片段大于1200bp(部分物种达不到);

3、克隆阳性率大于95%。

 

酵母文库的筛选方法

 

首先, 在进行蛋白质相互作用的酵母双杂交筛选时蛋白质相互作用的酵母双杂交筛选时,使用的菌株类型会根据研究的体系而有所不同。对于核内蛋白质的相互作用研究,通常采用Y2HGold酵母菌作为共转方式的筛选平台;而对于膜相关蛋白质的研究,则更倾向于使用NMY51菌株。在核内体系的研究中,除了共转筛选方法外,还可以采用配对(mating)方法。配对方法涉及到两种不同性别的酵母菌株:一种是携带AD文库质粒的Y187菌株,另一种则是含有BD(结合域)质粒的Y2HGold菌株。通过这两种菌株的交配,可以高效地筛选和鉴定蛋白质之间的相互作用。

以下是两种体系的筛库主要流程:

核体系筛库实验流程:

膜体系筛库实验流程:

在酵母双杂交系统中,筛选阳性克隆的方法会根据研究的体系(核内或膜相关)而有所区别。对于核内体系,通常使用MEL1作为报告基因。当蛋白质间发生相互作用时,含有X-α-Gal的培养基上的阳性菌落会显现蓝色。而在膜相关体系中,筛选阳性克隆主要依赖于报告基因ADE2的表达水平。具体来说,当不存在蛋白质相互作用时,腺嘌呤的合成受到阻碍,导致细胞中某些中间产物积累,使得细胞表现为红色。这种颜色变化为鉴定蛋白质间相互作用提供了一种可视化的方法。(2)有互作蛋白时,由于作用强度不同克隆颜色不一。克隆呈现粉白(弱相互作用)至白色(强相互作用)。

 

案例

 

酵母双杂交文库构建及文库筛选服务文献案例:

1、 total RNA提取:

 

2、 mRNA纯化

 

3、初级文库片段长度与阳性率验证

初级文库:长度范围300-3000bp,平均长度>1200bp,阳性率100%

4、次级文库片段长度与阳性率验证

次级文库:长度范围:650-3000bp,平均长度>1200bp,阳性率100%