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酵母双杂交常见问题

2023-09-21 阅读(18)

1:酵母双杂交的实验原理是什么?

 

答:简单来说,将已知基因构建到可以表达BD结合结构域的载体上,表达形成融合诱饵蛋白(bait),将目标基因构建到可以表达AD激活结构域的载体上,表达形成融合猎物蛋白(prey)。如果诱饵蛋白和猎物蛋白发生互作,BD结合结构域和AD激活结构域在空间上极为接近,GAL4转录因子发生重构,恢复了转录因子的功能,可以激活报告基因的表达。通过检测报告基因的表达与否,从而推测猎物蛋白和诱饵蛋白是否发生相互作用。

 

2:BD和AD分别指的是什么?

 

答:GAL4转录因子含有两个结构域,一个是位于N端的BD结合结构域,一个是位于C端的AD激活结构域。BD结合结构域的功能是识别并结合在相应基因上游的激活序列上,AD激活结构域的功能是激活相应基因的表达。实验中诱饵简称BD,猎物简称AD。

 

3:GAL4转录因子的应用原理是什么?

 

答:GAL4双杂系统中,将BD结合结构域和AD激活结构域分开,AD激活结构域无法与激活序列结合,而BD结合结构域不具有激活功能,将无法激活相应基因的表达。再利用融合蛋白的互作结合,使AD激活结构域和BD结合结构域发生重构,恢复GAL4转录因子的功能。  

 

4:筛选标记和报告基因的作用是什么?

 

答:质粒的组成元件包括复制起始位点、抗性基因、多克隆位点、启动子、引物结合位点、筛选标记等。酵母双杂实验中,选择的质粒的筛选标记多为氨基酸缺陷型标记。用对应的缺陷型培养基筛选可以确定质粒是否成功转入受体酵母菌。检测报告基因表达与否,即可说明GAL4是否发生转录。报告基因表达即为蛋白互作的结果。

 

5:筛选标记和报告基因的检测方法是什么?

 

答:筛选标记的检测方法为通过缺陷型培养基筛选。pGADT7转化对应的筛选标记为Leu2,pGBKT7转化对应的筛选标记为Trp1。筛选标记为Leu2时,需要用单缺亮氨酸的筛选培养基(SD/-Leu),筛选标记为Trp1时,需要用单缺色氨酸的筛选培养基(SD/-Trp)。HIS3和ADE2报告基因检测需要用His和Ade缺陷型筛选培养基。MEL1报告基因需要用X-α-gal检测,lacZ报告基因需要用X-gal检测,AbAr报告基因需要用金担子素(AbA)检测。

 

6:GAL4双杂系统常用质粒和菌种有什么?

 

答:常用的载体为pGBKT7和pGADT7。两种载体均为穿梭载体,同时包含大肠杆菌和酵母菌的复制起始位点,并含有不同的抗性以及氨基酸缺陷型筛选标记。常见的菌种有Y2HGold、AH109、Y187。根据实验方案选择合适的酵母菌即可。

 

7:如何选择菌种?

 

答:酿酒酵母交配是细胞与细胞融合的典型事件。酿酒酵母具有两种不同的单倍体细胞类型,分别为MATa型(a型)和MATα型(α型)。当这两种交配型的细胞紧密靠近时,它们可以融合成为二倍体细胞(MATa/α型)。Y2HGold和AH109都属于a型,Y187属于α型。所以Y2HGold、AH109均可以与Y187融合,但是AH109和Y2HGold不能发生融合。如果用mating方式进行酵母双杂,必须选择Y187酵母菌,Y2HGold和AH109可任选其一。如果用共转的方式进行酵母双杂,Y2HGold或者AH109均可以,无需选择Y187酵母菌。

 

8:AH109和Y2HGold有什么区别?

 

答:AH109和Y2HGold在双杂实验中选一种即可,所有实验操作方法都一样。但是Y2HGold和AH109的报告基因有区别,它们共有的筛选标记为Trp1和Leu2,共有的报告基因为HIS3,ADE2,MEL1。AH109特有报告基因为lacZ,Y2HGold特有的报告基因为AbAr。

 

9:共转和mating分别是什么意思?

 

答:共转和mating指的都是将诱饵和猎物整合到同一个酵母细胞中的实验方法。共转指的是将两个质粒(其中一个可为文库质粒)同时转入同一个酵母细胞;mating指的是将两个质粒(其中一个可为文库质粒)分别转入两个不同类型(a型和α型)酵母菌中,利用两个不用类型的酵母细胞可以融合成为二倍体的特性,从而将两个质粒构建到同一个酵母细胞中。

 

10:什么条件下选择共转方式?

 

答:如果是互作验证,推荐用共转的方式。选择Y2HGold或AH109酵母感受态细胞,把连有目的基因的BD、AD同时转化到感受态细胞中,然后用二缺培养基(SD/-Leu-Trp)筛选转化子。与分步转化和mating相比,共转只需要3天即可完成,是最为简便的方法。如果是文库筛选,文库形式为质粒文库或者cDNA文库,也可以共转,但更推荐分步转化。分步转化指的是先将诱饵转化到Y2HGold或AH109酵母感受态细胞中,然后再将文库转化到已经包含诱饵的感受态细胞中。分步转化得到的转化子更多,意味着有更多的文库基因参与到互作筛选中。

 

11:什么条件下选择mating方式?

 

答:在文库筛选实验中,如果文库是酵母菌库的形式,推荐使用mating的方式进行。将诱饵转入Y2HGold或者AH109中,用SD/-Trp培养并制备具有特定浓度的诱饵菌,将诱饵菌和文库菌在一定条件下培养融合为二倍体细胞,从而达到把诱饵和猎物同时转化到同一个酵母细胞的目的。

 

12:酵母双杂交的主要用途有哪些?

 

答:发现与已知蛋白互作的蛋白(通常利用筛库来实现);确认两个蛋白之间的相互作用;鉴定参与蛋白相互作用的区域。

 

13:酵母双杂交为什么要检测自激活?

 

答:理论上BD可单独与GAL4上游活化序列UAS结合,但不能引起转录。但是如果将一段具有转录激活活性的转录因子构建到BD载体上,若其表达产生的诱饵蛋白单独与UAS结合后能引起下游报告基因的转录,则说明bait具有自激活现象。另外酵母细胞的某些具有转录激活活性的内源蛋白也可能与诱饵蛋白互作。这样就无法判断报告基因的表达是不是由于bait和prey互作导致的。所以只有在排除自激活的基础上,才能判断bait和prey是否互作。在互作验证中,如果不进行自激活检测,不设对照组,而直接进行互作验证,无法判断实验结果是否可信;在文库筛选实验中,如果不进行自激活检测,而直接进行文库筛选,极有可能得到大量的假阳性转化子,增加后期数据处理的难度。

 

14:如何选择合适的报告基因进行自激活检测?

 

答:酵母双杂是一个复杂的实验,可以把整个实验拆分为多个独立的小实验来完成,如自激活检测、后续的筛库或者验证实验。首先确定筛库或者验证实验的初筛条件,即检测哪个报告基因,再通过检测诱饵能否激活该报告基因,来确定诱饵是否存在自激活现象。如自激活检测的是HIS3报告基因,而文库筛选时检测的是AbAr和MEL1报告基因,那么这个自激活检测无法服务于文库筛选。  

 

15:常用自激活检测的报告基因有哪些?

 

答:诱饵的自激活,是通过报告基因的表达来检测的。双杂报告基因包含HIS3,ADE2,MEL1,lacZ以及AbAr,理论上所有的报告基因都可以用于自激活检测。但常用双杂自激活检测的报告基因只有AbAr+MEL1组合或者HIS3。现有实验技术,AbAr和HIS3产生的自激活更容易获得相应的抑制剂。

 

16:AbA(金担子素)为什么可以抑制自激活?

 

答:AbA 作用机制是抑制酵母中AUR1基因编码的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide,IPC)合成酶的活性,干扰鞘脂合成,从而杀死菌株。Y2HGold的报告基因AbAr被激活后,可以使酵母菌对AbA产生抗性。同时利用AbA(金担子素),可以抑制报告基因AbAr一定范围内的自激活。

 

17:3-AT为什么可以抑制自激活?

 

答:3-AT是组氨酸的竞争性抑制剂,可以抑制HIS3的泄露表达和轻微自激活现象。

 

18:选择AbAr+MEL1组合进行自激活检测的优势与局限性?

 

答:AbAr+MEL1指的是通过检测报告基因AbAr和MEL1是否激活来判断诱饵是否存在自激活,利用SD/-Trp+AbA+x-α-gal进行双报告基因筛选,可以兼顾转化效率和假阳性率。

此组合只适用于Y2HGold酵母菌(不适用于AH109酵母菌)。

 

19:选择HIS3进行自激活检测的优势与局限性?

 

答:HIS3指的是通过检测报告基因HIS3是否激活来判断诱饵是否存在自激活,此报告基因适用于Y2HGold和AH109酵母菌。选用Y2HGold酵母菌,两种自激活检测的方式都可以,而选用AH109酵母菌,只可选择检测HIS3自激活。由于HIS3筛选标记有泄露表达,通常需要和一定浓度的3-AT一同筛选,相比AbAr+MEL1实验准备阶段稍显复杂。

 

20:AbAr+MEL1组合自激活检测实验设计上有什么建议?

 

答:转化BD-bait到Y2HGold感受态细胞中,分别涂布SD/-Trp以及SD/-Trp+AbA+x-α-gal(AbA初始浓度设为100 ng/mL)平板进行检测。培养3天左右,如果SD/-Trp+AbA+x-α-gal平板不能长出转化子,或者转化子远远少于SD/-Trp平板并且不变蓝,可以判断诱饵没有自激活或者该浓度的AbA可以抑制自激活;如果两个平板菌落数接近,而且SD/-Trp+AbA+x-α-gal平板菌落变蓝,判断诱饵有自激活。

没有自激活的诱饵可以直接用于后续实验。存在自激活的诱饵,设置AbA浓度梯度进行筛选,如果某浓度(<1000 ng/mL)的AbA抑制诱饵菌的生长,那么选定该浓度的AbA作为后续实验的筛选浓度。

 

21:HIS3自激活检测实验设计上有什么建议?

 

答:转化BD-bait到Y2HGold/AH109感受态细胞中,分别涂布SD/-Trp、SD/-His-Trp、SD/-His+3-AT(3-AT设置梯度浓度)平板进行检测。培养3天左右,SD/-Trp平板长出合理数量大小的转化子,SD/-His-Trp平板不能长出转化子,可以判断诱饵没有自激活;如果SD/-His-Trp平板长出转化子,但是SD/-His-Trp+3-AT(X浓度)不能长出转化子,说明诱饵有自激活,但是X浓度的3-AT可以抑制自激活。选定该浓度的3-AT作为后续实验的筛选浓度。

 

22:AbA和3-AT的浓度梯度如何设置,是否有上限?

 

答:虽然不同的资料给出的浓度范围有区别,但是大体近似。AbA的浓度范围为0-1000 ng/mL,原则上尽可能使用低浓度的AbA,常设浓度为200 ng/mL;3-AT的浓度范围为0-80 mM,常设浓度为2.5-30 mM。预实验可以设置AbA初筛浓度为200 ng/mL;3-AT初筛浓度为2.5 mM。如果存在自激活现象,再设跨度较大的浓度梯度筛出最佳浓度。AbA浓度增加到1000 ng/mL,3-AT浓度增加到80 mM,不能抑制诱饵菌的生长,说明此诱饵自激活过强,无法进行酵母杂交实验。

 

23:互作验证实验,有推荐的快速自激活检测方案吗?

 

答:互作验证实验,推荐自激活和互作实验同时进行,可以最大程度推进实验进度,并获得可靠的结论。具体方案为:

1)BD-bait和AD-prey质粒混合作为实验组,将BD-bait和空载AD质粒混合作为自激活组。将自激活组和实验组分别共转到Y2HGold或AH109感受态细胞中。

2)用SD/-Leu-Trp平板筛选转化子,并将转化子用SD/-Leu-Trp液体培养基扩繁。

3)菌液稀释多个梯度,在同一个互作验证的缺陷培养基平板上点板,同时点SD/-Leu-Trp平板做对照。

4)分析结果。SD/-Leu-Trp平板自激活组和实验组菌落生长无区别,互作验证平板自激活组不长而实验组长,说明诱饵无自激活而且实验组互作成立;互作验证平板自激活组和实验组都长,说明诱饵有自激活而无法判断实验组是否互作。

5)如果有自激活,互作验证平板增加梯度浓度的3-AT或者AbA。如果在某个互作验证平板上出现自激活组不长而实验组长,说明诱饵有自激活但能被该浓度的3-AT或者AbA抑制,而且实验组互作成立。如果自激活组和实验组在某个浓度均不能生长,说明诱饵有自激活,虽然能被该浓度的3-AT或者AbA抑制,但是实验组不互作。如果自激活组和实验组一直可以生长,而且生长趋势一致,说明诱饵自激活过强,不可用于互作验证实验。

 

24:同一个诱饵,为什么会出现自激活抑制结果不一致的情况?

 

答:实验者容易忽视涂板或者点板的菌浓度对自激活抑制结果的影响,其实菌浓度是造成自激活抑制结果不一致的主要原因。类似于对人体的抗生素用药,应该根据体重确定用药剂量,同样道理同一浓度的AbA或者3-AT对于不同数量菌的抑制效果也不一样。

 

25:涂板或者点板怎么设定菌浓度呢?

 

答:涂板或者点板,生长出来的菌落为单菌落,无论菌落密集程度,只要平板菌落是单菌落的状态,不成片也不成团,那么该菌浓度在合理范围,重复实验的筛选浓度也以此为准。涂板时,建议菌浓度为OD=0.002,直径9 cm的培养皿涂布100 μL;点板时,控制初始菌浓度OD值0.1-0.5之间,常设0.2,按十倍梯度再稀释3个浓度,每个浓度点10 μL。AbA或者3-AT的有效浓度只以OD值0.0002的菌浓度的筛选结果为准,此浓度菌在不含筛选性的平板上,理论上可以得到20个单菌落。