1.酵母单杂交的实验原理是什么？

答：

酵母单杂交技术是由酵母双杂交GAL4系统衍生发展而来，是一种在酵母细胞内分析与鉴定转录因子与DNA顺式作用元件相互结合的有效方法。简单来说，将已知特定顺式元件构建到最基本启动子（minimal promoter, Pmin）的上游，报告基因连接在启动子下游，构成包含target DNA Element(bait sequence)的诱饵DNA。将转录因子构建到可以表达AD激活结构域的载体上，表达形成融合猎物蛋白（prey）。如果顺式作用元件和转录因子结合，会激活Pmin启动子，从而促使报告基因。因此，可以通过检测报告基因表达与否来判断顺式作用元件与转录因子是否发生互作。

2. 诱饵DNA有什么要求？

答：

诱饵DNA一般会选择顺式作用元件或者启动子序列。顺式作用元件作为诱饵时尽量使用短的顺式作用元件（一般＜20 bp），串联重复2-3次作为诱饵DNA；如果顺式作用元件超过100 bp，使用1个拷贝即可。启动子序列作为诱饵时不要包含TATA box。如果启动子序列小于100 bp，使用2个拷贝作为诱饵。如果超过100 bp，使用1个拷贝作为诱饵。

3. 常用的最基本启动子有哪些，其对应的下游报告基因是什么？

答：

有3种常用的最基本启动子，分别为pHis2载体的PminHIS3启动子，报告基因为HIS3；pLacZ载体的PCYC1启动子，报告基因为LacZ；pAbAi载体的iso-1-cytochrome C启动子，报告基因为AbAr。

4. 单杂系统常用质粒和菌种有哪些？

答：

常用质粒有pHis2、pABAi、pLacZi、pGADT7、pGADT7-REC、pB42AD等，除pLacZi外均为穿梭质粒，同时包含大肠杆菌和酵母菌的复制起始位点，并含有不同的抗性以及氨基酸缺陷型筛选标记。pGADT7-Rec和pGADT7二者功能相同，但为了方便文库转化，前者插入了特定的可以与文库发生同源重组的序列。pB42AD和pGADT7载体相似，都带有GAL4转录因子的激活结构域序列。

常用菌种有Y1HGold、Y187、EGY48、YM4271等，其中EGY48与YM4271互为伴侣菌株，可以mating。根据实验方案选择合适的酵母菌及对应的载体。

5. 筛选标记和报告基因的作用及检测方法是什么？

答：

质粒的组成元件包括复制起始位点、抗性基因、多克隆位点、启动子、引物结合位点、筛选标记等。酵母单杂实验中，选择的质粒的筛选标记多为氨基酸缺陷型标记。用对应的缺陷型培养基筛选可以确定质粒是否成功转入受体酵母菌。

酵母双杂中往往有多个报告基因可以同时检测，但是单杂中的报告基因一般只有一个。通过对应筛选条件检测该报告基因是否表达，可以判断Pmin是否激活，从而判断顺式作用元件是否和转录因子互作。如HIS3报告基因为用HIS缺陷型的培养基检测，LacZ报告基用X-gal显色缺陷型培养基（SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal）检测，AbAr报告基用加入了AbA的缺陷型培养基检测。

6. 常用的酵母单杂系统有哪些？

答：

常用的酵母单杂系统有Y1Hgold（pABAi+pGADT7 / pGADT7-REC），Y187（pHis2+pGADT7 / pGADT7-REC），EGY48（pLacZi+pB42AD）。三种单杂体系未发现有明显的优劣之分。

7. 三个酵母单杂系统主要区别？

答：

1）pAbAi-Bait（DNA）+pGADT7rec或者pGADT7；Y1HGold菌株。插入目的DNA的pAbAi载体需要线性化后转到Y1HGold菌株，制成Bait菌株；筛选标记AbA；

2）pHIS2-Bait（DNA）+pGADT7；Y187菌株。Bait不需要整合到酵母基因组，不需要线性化；筛选标记His+3-AT。

3）pLacZi-Bait（DNA）+pB42AD；EGY48菌株。Bait载体需要线性化整合到酵母基因组；筛选标记X-gal。

8. pAbAi-bait线性化的内切酶如何选择？

答：

pAbAi-bait线性化时候选择BstBl或者BbsI均可，不可使用其它内切酶。

9. pAbAi-bait酶切产物胶回收效率太低如何解决？

答：

酶切产物回收标准流程为：跑大孔胶→切胶→溶胶→结合→洗涤→洗脱。此方法得到的酶切产物纯度高，但是回收率低。酶切后取少量电泳检测已酶切完全（只有一条带），无需跑胶→切胶→溶胶，直接进行结合→洗涤→洗脱步骤，可有效减少损耗。建议酶切载体加入量1 μg以上。

10. 酵母单杂交的主要用途有哪些？

答：

验证已知DNA与蛋白之间是否存在相互作用；分离结合于目的顺式调控元件或其它短DNA结合位点蛋白的新基因；定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域，以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。

11. 酵母单杂交为什么要检测自激活？

答：

Pmin启动子自身会导致下游的报告基因有本底表达，而且克隆到载体的顺式作用元件有可能会与酵母内源性转录因子结合，所以说自激活是个普遍存在的现象。只有在没有内源性转录因子可以与顺式作用元件结合或者结合能力非常弱的前提下，报告基因的本底表达才可以被抑制，单杂实验才可以继续。

12. 诱饵存在自激活怎么办？

答：

pAbAi-bait存在自激活，需要设置梯度浓度AbA的SD/-Ura平板培养；pHis2-bait存在自激活，需要设置梯度浓度3-AT（SL0930）的SD/-His/-Trp平板培养，进一步检测自激活的强度。

13. AbA的浓度梯度怎么设置？

答：

AbA的初筛浓度建议设置0、50、100、200 ng/mL。根据初筛诱饵菌落生长情况，再设置下一轮的AbA浓度梯度。例如诱饵菌落可以在50 ng/mL的培养基生长而不能在100 ng/mL的筛选培养基生长，可以选择100 ng/mL作为后续AbA的使用浓度，或者在50-100 ng/mL之间设置梯度再进行筛选。又例如诱饵菌落在200 ng/mL的培养基上有生长但是弱于0 ng/mL的培养基，可以设置250、300、350、400 ng/mL的AbA做进一步筛选；而诱饵菌落在200 ng/mL和0 ng/mL的培养基上生长无任何区别，可以设置400、600、800 ng/mL做进一步筛选。理论上AbA的浓度不应超过1000 ng/mL。

14. 涂板或者点板时如何设定菌浓度？

答：

涂板或者点板，生长出来的菌落为单菌落，无论菌落密集程度，只要平板菌落是单菌落的状态，不成片也不成团，那么该菌浓度在合理范围，重复实验的筛选浓度也以此为准。涂板时，建议菌浓度为OD=0.002，直径9 cm的培养皿涂布100 μL；点板时，控制初始菌浓度OD值0.1-0.5之间，常设0.2，按十倍梯度再稀释3个浓度，每个浓度点10 μL。AbA或者3-AT的有效浓度只以OD值0.0002的菌浓度的筛选结果为准，此浓度菌在不含筛选性的平板上，理论上可以得到20个单菌落。

15. 如果出现自激活无法抑制情况怎么办？

答：

1）首先核对菌落涂布方法。实验者容易忽视涂板或者点板的菌浓度对自激活抑制结果的影响，其实菌浓度是造成自激活抑制结果不一致的主要原因。类似于对人体的抗生素用药，应该根据体重确定用药剂量，同样道理同一浓度的AbA或者3-AT对于不同数量菌的抑制效果也不一样。

2）核对自激活体系是否正确。建议选用pAbAi-P53做对照，已知pAbAi-P53存在自激活，而且100-200 ng/mL的AbA可以抑制其自激活现象。如不能抑制，则说明筛选培养基配制错误。

3）当AbA浓度达到1000 ng/mL，或3-AT浓度达到80 mM，诱饵自激活还是无法抑制，那说明插入的Bait自激活过强，无法进行筛库以及验证实验。需要重新构建Bait。