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ELISA检测

2023-12-19 阅读(103)

一.酶联免疫吸附测定(ELISA)

 

通过使用酶联偶联物和底物获得的颜色变化来显示抗原-抗体反应的定量分析方法,用于鉴定生物流体中分子的存在和浓度,通常成为酶联免疫吸附测定。浓度较低的分子,例如多肽/蛋白质、维生素和药物、激素,对为其开发的抗体或抗原表现出高水平的特异性。因为抗体几乎不可能与自身抗原以外的分子结合。因此,当我们知道抗原对某种物质具有特异性时,我们可以识别其抗体的类型和数量,当我们有抗体时,可以通过该方法找到其特异性抗原和抗原的数量。

 

二.ELISA检测方法是如何工作的?

 

在ELISA方法中常用刚性聚苯乙烯、聚氯乙烯和聚丙乙烯制成的管和微孔板作为固相。所使用的微孔板必须能够适当地吸附抗原和抗体,但不能吸附其他相中的成分。

可用于ELISA的酶包括半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。碱性磷酸酶可与其偶联叠氮化钠一起储存在4℃。碱性磷酸酶和P-硝基苯基磷酸被当作底物,又安全的片剂形式,在阳性反应中产生黄色。对于过氧化物偶联物,用5-氨基水杨酸和正苯二胺作为底物,产生棕色被认为是正反应。如果使用半乳糖苷酶,则必须在荧光计中读取样品。酶-底物反应通常在30-60分钟内完成,可使用氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCL)或硫酸(H2SO4)停止反应。根据所使用的共轭物的特性,在400-600nm的分光光度计上读取结果。

 

三.ELISA检测的类型

 

(1)直接ELISA检测:适用于测定高分子量抗原的量。在检测板表面直接包被抗体或抗原。酶标记的抗体或抗原使测量成为可能。孵育后进行洗涤,将未结合的抗原或抗体从培养基中去除。然后将适当的底物添加到培养基中,通过着色产生信号。测量信号反应了抗原或抗体的量。

(2)间接ELISA检测:之所以被称为间接法,是因为分离待测抗原的不是一抗而是放置在培养基中的另一种抗体。例如:将患病血清加入抗原包被的孔中,培养皿孵育,为了使抗原-抗体复合物可见,需要添加一种能识别血清中该抗体并被酶标记的二抗。然后将酶的底物加入培养基中产生颜色,并测定浓度。

(3)夹心ELSIA检测:将样本加入到包被抗体的微孔板中,然后将板孵育一段时间并洗涤。洗去未结合的抗原,当发现结合抗体的特异性抗原时,这些抗原就不能被去除。在洗涤步骤之后,加入带有抗原特异性酶标记的抗体并进行孵育。在孵育和洗涤之后,如果培养基中有抗原,这些抗原就不能被去除,因为酶标记的抗体与抗原结合在一起。为了揭示酶的活性,在培养基中加入酶底物,保证染色。着色表明阳性结果,而不着色表明酶缺乏或阴性结果,由于相关蛋白被夹在两个抗体分子之间,因此该方法被称为三明治夹心ELISA。夹心ELISA的敏感性是其他ELISA法的2-5倍。

(4)竞争性ELISA检测:在孔的表面涂上抗原特异性抗体或抗体特异性抗原。将待测样品和被标记的抗原或抗体同时放入孔中,标记的和未标记的抗原(患者抗原)或抗体分子相互竞争,与孔中的抗体或抗原结合。在洗净孔中加入酶底物后,所得到的着色可以定量测定浓度。分析物浓度与所得显色强度成反比。当抗原的量或血清中分析的抗体低,获得高吸光度,而大量产生低吸光度。

 

四.不同类型的酶联免疫吸附试验(ELISA)的优缺点

 

优点

缺点

直接ELISA

(1)快速;(2)二抗交叉反应性被消除。

(1)低灵敏度;

(2)需要针对每个ELISA的特异性抗体;耗时且昂贵。

间接ELISA

(1)高灵敏度;

(2)节约成本;

(3)灵活;可以使用许多一抗。

 

有二抗间交叉反应的风险

夹心ELISA

(1)需要最少的样品纯化;

(2)高灵敏度和特异性。

(1)必须使用“配对”的一抗和二抗;

(2)耗时且昂贵。

竞争ELISA

(1)最小的样品纯化需要;

(2)用于测量大范围的抗原在一个样品;

(3)用于小抗原;

(4)低变异性.

 

特异性低,因此不能用稀释样品

 

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