用于有效体内递送治疗性蛋白质的工程病毒样颗粒

体内递送基因编辑剂的方法因为核糖核蛋白可以提供优于核酸递送方法的安全优势。我们报告了工程化的无 DNA 病毒样颗粒 (eVLP) 的开发和应用，该颗粒可有效地包装和传递碱基编辑器或 Cas9 核糖核蛋白。通过设计 VLP 以克服货物包装、释放和本地化瓶颈，我们开发了第四代 eVLP，可在几种主要的小鼠和人类细胞类型中进行有效的碱基编辑。在 eVLP 中使用不同的糖蛋白会改变它们的细胞趋向性。将 eVLP 单次注射到小鼠体内支持治疗水平的多个组织中的碱基编辑，在 63% 的肝脏编辑后将血清 Pcsk9 水平降低 78%，并在遗传性失明的小鼠模型中部分恢复视觉功能。体外和体内来自 eVLP 的脱靶编辑几乎未被检测到，这是对 AAV 或质粒递送的改进。这些结果确立了 eVLP 作为治疗性大分子递送的有前途的载体，它结合了病毒和非病毒递送的关键优势。

结论

我们开发了一个高效的工程化 VLP 平台，可以安全地为治疗相关的离体和体内应用提供 RNP。通过识别和设计解决 VLP 传递效率的三个不同瓶颈的解决方案，与基于先前报道的 VLP 支架的初始设计相比，我们将 v4 eVLP 内的蛋白质装载量平均提高了 16 倍，碱基编辑效率平均提高了 8 倍. 我们的研究结果表明，v4 eVLP 用途广泛，适用于各种离体和体内编辑应用程序。我们还预计，除了 BE 和核酸酶之外，eVLP 架构将作为一个模块化平台，用于传递其他感兴趣的蛋白质或 RNP。

我们的研究结果强调了使用合理工程进一步推进基因编辑剂递送平台的潜在治疗益处。虽然以前使用 VLP 来传递 Cas9 核酸酶 RNP，最近的一项研究使用 VLP 将 BE RNP 传递到 HEK293T 细胞，其效率低于此处描述的 eVLP，据我们所知，以前没有研究报告过使用 RNP 递送 VLP 进行的任何类型的出生后体内基因编辑的治疗水平。在这项工作中开发的 eVLP 平台使用我们定制的合理设计的架构，以包装更多的货物并提高粒子滴度。这些 eVLP 可以介导小鼠体内多个器官和给药途径的体内碱基编辑治疗水平，从而使用迄今为止报道的 RNP实现最高水平的出生后体内基因编辑。

单次静脉注射 eVLPs 介导小鼠肝脏中Pcsk9的碱基编辑，效率 > 60%，与当前最先进的 BE 递送方法和 LNP 介导的 BE 编码 mRNA 传递 。然而，与 AAV 介导的 DNA 递送和 LNP 介导的 mRNA 递送策略相比，eVLP 具有关键优势。AAV 介导的递送可导致可检测水平的病毒基因组整合到转导细胞的基因组中，这可导致肿瘤发生。而 eVLP 缺乏 DNA，因此应避免插入诱变的可能性。此外，AAV 介导的递送会导致货物表达时间延长，这会增加基因编辑剂递送时脱靶编辑的频率。相反，正如我们在体外和体内所展示的那样，瞬时 eVLP 介导的 BE RNP 传递大大减少了脱靶编辑的机会。虽然 LNP 介导的 BE 编码 mRNA 的传递也是短暂的，但传递 BE RNP 提供了更短的与编辑剂的接触和更低的脱靶编辑机会，因为与 mRNA 相比，细胞中 RNP 的寿命更短，每个拷贝都会产生细胞整个 mRNA 生命周期中的 RNP。

虽然 LNP 可以有效地包装 mRNA，但在 LNP 中包装基因编辑剂 RNP 更具挑战性。由于 eVLP 可以在肝脏中实现与这些其他策略相当的编辑水平，但具有上述重要优势，因此它们是进一步发展作为治疗遗传性肝病的体内编辑方法的一种特别有吸引力的选择。v4 BE-eVLP 架构对于在小鼠肝脏中实现稳健的编辑至关重要，与之前报道的 (v1) VLP 设计相比，体内编辑效率提高了 26 倍，强调了工程化 VLP 架构的重要性体内编辑。在此Pcsk9上观察到的碱基编辑程度 具有 v4 BE-eVLPs (>60%) 的剪接供体被认为足以降低血清 LDL 和治疗高胆固醇血症。

在 LCA 小鼠模型中单次视网膜下注射 v4 BE-eVLPs 有效地纠正了致病点突变并恢复了视觉功能。在这个模型中，eVLP 再次实现了与之前使用病毒传递方法（包括慢病毒 BE 传递）所达到的编辑效率和拯救水平相当或更高的水平。 和 AAV 介导的 BE 传递 。眼睛的可及性及其免疫特权状态可能更容易将新的成果转化为临床前和临床研究。我们的数据提供了 BE-eVLP 作为纠正导致眼部疾病的致病性点突变的手段的治疗潜力的证据。

这里报告的发展结合了基因编辑剂的一次性治疗潜力和 RNP 的瞬时性质，以最大限度地减少不需要的脱靶编辑或 DNA 整合的机会，以及病毒转导的有效、组织靶向性质。因此，我们的研究结果表明，对于 BE、核酸酶和其他具有治疗意义的蛋白质的体内或离体递送， eVLP 作为其他递送策略的有吸引力的替代方案。

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