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蛋白质N端测序介绍

2023-11-07 阅读(155)

表达纯化后的蛋白产物,特别是蛋白品的分析过程中,需要对蛋白的末端进行验证,以保证表达纯化产物的N端和C端序列准确。Edman降解法是蛋白的N端序列分析中非常成熟的方法之一,有着广泛的应用。卡梅德生物采用岛津公司Edman测序系统(PPSQ-31A),为广大科研工作者和科研客户提供纯化后蛋白产物、抗体以及蛋白疫苗的N端测序服务。采用我们的测序系统,可以测定N端30个氨基酸的序列信息。采用特定的蛋白上样系统,通过Edman降解法能够准确的测定蛋白质N端多达67个氨基酸序列。

 

蛋白质的N端测序技术

 

一、Edman降解原理

用异硫氰酸苯酯测定肽链的N末端氨基酸的PTH法,又称为Edman降解法(异硫氰酸苯酯法)。Edman降解法的基本原理是异硫氰酸苯酯(PITC)能在温和条件下与含有自由氨基的多肽或蛋白质发生偶联反应,生成的苯氨基硫甲酰衍生物经过环化,从肽链上断裂下来,然后转变为PTH-氨基酸。利用PTH-氨基酸在紫外光下有强吸收,可以用色谱进行鉴定。

Edman降解测序主要是通过循环反应从蛋白质的N端一一鉴定氨基酸类型,从而确定蛋白质的N端序列。总的来说,在每个测序循环中,首先先由Edman测序仪分离的PTH-氨基酸,接着使用HPLC分别测定PTH-氨基酸图谱,再与20中氨基酸的标准HPLC图谱,从而得到对应的氨基酸的信息。

 

二、Edman降解测序步骤:

① 偶联反应 碱性条件下、在氮气中,异硫氰酸苯酯与N末端的氨基反应形成苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽)的衍生物。

② 洗涤 除去过量的PITC和缓冲液后的样品被彻底干燥。

③ 裂解反应 在无水酸的作用下,PTC-肽发生特异性裂解,产生游离的初始N末端氨基酸的噻唑啉酮和丢失了原N末端残基的变短的多肽。

④ 萃取 将噻唑啉酮萃取至疏水有机溶剂中,与变短的多肽分离。

⑤ 转化反应 在稀酸作用下,使不稳定的噻唑啉酮转换为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸 (PTH-氨基酸)。

⑥ 鉴定 用TLC或 HPLC分析,与标准图谱比较鉴定PTH-氨基酸。

 

图1 蛋白质Edman的测序流程

 

蛋白质N端测序的局限性

 

Edman降解法作为现有蛋白质样品N端序列测试的黄金标准,已得到广泛应用。但是在实际应用中,Edman降解法也有一定的局限。例如,蛋白的N端进行测序,将样品转移到PVDF膜上之后测序过程中没有任何信号,并且重复的依然如此,推测蛋白可能发生了N-末端封闭。

蛋白质的N端在未封闭的情况下具有自由的α氨基,PITC与α氨基反应是Edman降解测序反应的第一步。当蛋白质N端发生封闭时,N端的α氨基被修饰使得N端缺乏自由的α氨基,导致PITC实际无法与蛋白质结合,使得Edman降解反应无法进行下去。其实在自然界中,50%的天然蛋白质N端都经过了修饰,常见的修饰包括乙酰化、甲基化、焦谷氨酸化等。另外,有时在蛋白样品的分离提纯过程中也有可能产生N端封闭修饰,这个主要是由于溶液中的去垢剂或化学物质与蛋白样品N端功能基团反应,或者分离提纯使用的溶剂的pH值过高导致的。

由于目前Edman降解法用于蛋白质N端封闭的情况是无法进行测序的。在这种情况下可以通过蛋白酶切成多肽片段再使用液相色谱与质谱联用的方法进行序列测定,如果造成蛋白质N封闭的修饰是已知的,可以使用相对应的蛋白酶切除N端的修饰,接着就可以使用Edman降解反应进行测序。例如,许多抗体类药物的N端存在焦谷氨酸环化封闭,当使用焦谷氨肽酶酶解后,就可以直接使用Edman降解法对抗体进行测序工作。

 

蛋白质N端测序的生物学功能

 

蛋白质的合成从N端开始,蛋白质N端的序列组成影响蛋白质的整体生物学功能。通过揭示蛋白质多肽链的起始位置,研究蛋白质修饰和功能区域,研究蛋白质的异构体和变体,以及辅助药物研发和生物制药等方面的应用,N-端测序为我们解析蛋白质的奥秘提供了关键的手段。在未来,随着技术的不断发展,N-端测序将继续为蛋白质研究和生物制药领域的发展做出重要贡献。

 

卡梅德生物(KMD Bioscience)从事以生物质谱为依托的生物药物表征,大分子物质(包括蛋白质、多肽、代谢物)质谱分析以及小分子物质检测服务。设有独立蛋白质组学、互作组学、分子细胞实验室。实验室配置液相色谱质谱联用仪(LC-MS)、气相色谱质谱联用仪(GC-MS)、等电聚焦仪等大型精密仪器及各专业分析检测设备。实现数据结果的可追溯性,确保实验结果的准确性。

 

 

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