表2 常见E.coli蛋白表达系统技术问题与策略汇总

问题

可能的原因

解决策略

无或低蛋白表达

诱导前，蛋白有毒性

控制本底表达水平：
• 基于lac-based启动子表达，加入葡萄糖
• 选择以葡萄糖为碳源培养基
• 基于T7-based启动子表达，使用含有T7溶酶体质粒
• 使用严谨控制型质粒，降低拷贝数

诱导后，蛋白有毒性

控制诱导表达水平：
• 采用可调节启动子
• 采用可控制诱导菌株
• 降低拷贝数
• 采用适用毒性蛋白表达菌株
• 采取分泌性表达策略

密码子偏爱

优化质粒DNA密码子，以适应宿主密码子体系
使用密码子调整菌株
增加生物质：
• 尝试新培养基
• 改善通气条件，避免泡沐

包涵体形成

不正确的二硫键形成

采取分泌性表达策略
使用胞质具有氧化功能的E.coli

不正确的折叠

共表达分子伴侣
补充含有化合物伴侣和共因子的培养基
移除诱导剂，增加新鲜培养基
降低表达速率：
• 低温诱导表达
• 调整诱导剂浓度

低可溶性蛋白形成

改变融合伴侣蛋白，促进可溶蛋白表达

需要至关重要的翻译后修饰

改变表达宿主，如原核改变成真核表达系统

蛋白无活性

不正确的折叠

低温诱导表达
监控二硫键形成和进行体外折叠

cDNA突变

质粒诱导表达前后测序
使用recA−菌株以确保质粒宿主稳定性
改变表达宿主，如原核改变成真核表达系统