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重组抗体原核表达实验常见问题及解决方案

2024-02-01 阅读(75)

一.用于重组抗体原核表达的宿主有哪些?

 

大肠杆菌是最常用的宿主主要是因为其培养方法简单、廉价,配套使用的载体和菌株丰富,筛选平台明确,生产周期快速,对于培养基的要求简单。除了大肠杆菌之外,盐生假单胞菌和恶臭假单胞菌也可用于抗体生产,生产效率高于大肠杆菌。革兰氏阴性细菌在周质中分泌蛋白质,蛋白受空间和细胞机制的限制。革兰氏阳性菌(例如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、猪霍乱弧菌等)中缺少外膜的rAb表达克服了这一局限性,允许蛋白在细胞外表达,显示出高产量的抗体表达和分泌。

 

二.密码子优化对原核表达抗体的影响?

 

当所表达的目的基因中最佳密码子的频率与表达宿主显著不同,而不匹配的宿主调节翻译过程的tRNA时,就会出现密码子偏移。密码子偏移会影响多肽折叠、mRNA序列和稳定性、氨基酸插入的准确定等。mRNA序列决定了核糖体和蛋白质的结合,从而调节影响蛋白质合成的整体剪接和翻译机制。密码子偏移可以通过靶基因的密码子优化来适应宿主的tRNA库来解决(可以使用在线软件,例如Optimizer,Java Codon Adaptation Tool或GeneOptimizer)执行密码子优化),也可以通过修饰宿主以增加代表性不足的tRNA的可用性来解决。

 

三.基因优化对原核表达抗体的影响?

 

抗体中的可变区包含来自后续VDJ重组和体细胞超突变的高度多样化的序列,从而赋予抗体分子以特异性和亲和力。这些不同的序列有时可能会损害rAb的稳定性,使其易于聚集并降低表达。抗体结构(构架区或互补决定区(CDR))中的某些氨基酸不利于其以rAb形式表达,导致产量低下,尤其是在原核宿主中。将这些氨基酸替换为有利的氨基酸可以改善抗体的表达。

 

四.载体原件对原核表达重组抗体的影响?

 

理想的载体系统应该能够有效转录,mRNA加工,RNA转运和主要mRNA转录物的翻译,从而能够产生稳定的蛋白质。高效的载体系统不仅可以提高产量,还可以简化抗体的加工和纯化过程。通过优化载体的各组成部分(例如启动子,前导序列,融合蛋白和终止信号)增加了scFv-Fc的表达。常用的启动子有T7启动子,lac启动子,合成的trp启动子和trc启动子。可以通过使用绝缘子元件,普遍存在的染色质开放元件(UCOE),支架或核基质附着区域(A/MAR)以及稳定和抗阻遏元件(STAR)来克服位置效应,从而快速建立稳定的高产量克隆。

 

卡梅德生物基于成熟的蛋白表达平台建立了完善的重组抗体制备生产体系,拥有原核表达体系(包括但不限于BL21、Nissle 1917、Rosetta等多个原核表达宿主体系)、哺乳表达体系(包括但不限于Expi 293F、freestyle 293F、CHO-S、CHO-K1、293T等多个哺乳宿主体系)、酵母表达体系(包括但不限于GS115、X33等毕赤酵母表达体系和酿酒酵母表达体系)等多个适合抗体表达的体系,能满足客户的各种需求,欢迎咨询。