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Western blot实验步骤

2023-11-07 阅读(148)

1 Western blot原理介绍

 

Western blot是一种通过凝胶电泳分离蛋白质,将其印迹或转移到膜上,并对固定抗原进行选择性免疫检测的技术。这是一种重要的、常规的蛋白质分析方法,依赖于抗体-抗原相互作用的特异性,可用于从复杂混合物中定性或半定量地鉴定特定蛋白质及其分子量。

 

2 实验介绍

 

第一步是样品制备,需要将蛋白质溶解在缓冲液中,通常含有蛋白酶抑制剂和洗涤剂。可溶性蛋白样品用含有指示剂染料(如溴酚蓝)、阴离子变性洗涤剂十二烷基硫酸钠(SDS)和甘油的样品装载缓冲液浓缩物稀释。然后,在70至100°C之间加热5-10分钟可以对上样进行变性处理。这一过程将导致二级构象结构损失的蛋白质展开,并用带有负电荷的 SDS 分子将其包围,以便所有蛋白质在 PAGE 过程中向正极迁移。在热变性之前,可以向样品中添加化学还原剂,如二硫苏糖醇(DTT) 或 2-巯基乙醇,以破坏链内和链间二硫键,进一步展开复杂的二级和三级蛋白质结构。

随着电流的施加,凝胶中使用的聚丙烯酰胺的百分比以及缓冲系统将影响蛋白质通过凝胶的流动性。目标蛋白的预期大小可用于选择最佳的凝胶/缓冲体系,以实现最佳的分离和分辨率。制备的蛋白质样品在染料指示剂和甘油的帮助下,将样品装入凝胶孔中,施加电流,蛋白质通过凝胶迁移并通过电荷(与大小成正比)分离。并在一个凝胶孔中加入maker。

将凝胶分离的蛋白质转移并固定在硝化纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将膜洗涤、阻断,并用分析物特异性一抗孵育。两种常见的方法包括使用直接报告标记的一抗或报告标记的针对一抗宿主物种的二抗。与抗体偶联的报告体可以是多种多样的,例如产生颜色反应产物的酶或发光信号的酶暴露于底物或在特定波长激发产生的直接荧光信号时抗原抗体结合的位点。需要适合所产生的信号的检测系统和记录结果的一些手段。

 

3 实验步骤

 

3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

1. 将蛋白样品在4倍LDS样品缓冲液中按4:1稀释,得到35 μg/mL 1倍LDS蛋白溶液,70°C涡旋加热10 min。

2. 将样品在5000 × g下短暂离心。

3.用 ddH2O 制备 1 L MES 或 MOPS运行缓冲液。将稀释 20 倍至 1 倍。

4.从储存袋中取出预制凝胶,轻轻取出梳子,并从塑料凝胶盒底部取出胶带。

5.将凝胶盒紧贴橡胶密封件放置在缓冲罐中,凝胶孔的开口面向 上罐储层的内部。确保紧密配合,以创建一个单独的上下缓冲储层,因为电流将通过凝胶从顶部流向塑料凝胶盒底部的狭缝。

6.将运行缓冲液倒入上罐中,保证缓冲液不泄漏到下罐中;将剩余的缓冲液倒入下罐中,保持液体低于上罐。

7.用移液器和凝胶上样尖端从上储液器中取出液体,冲洗每个孔,去除储存的甘油和防腐剂。注意避免刺穿孔底或孔壁。

8.每孔装入等量的热变性 1x LDS 样品,并保留一条通道用于蛋白质maker。

9.盖上盖子,并将红色和黑色电缆连接到电源上。

10.打开电源,在 200 V恒定下运行凝胶 50分钟,并注意指示染料随时间的移动。

3.2 蛋白质从凝胶向膜的转移

1.通过稀释 20×原液(50 mL 20×原液,100 mL 甲醇,850 mL ddH2O)制备1 L 含10%甲醇的1×转移缓冲液。

2.将胶刀放在胶盒塑料板之间,拧开胶盒塑料板。取下一个面板,用剃须刀片将凝胶的顶部从孔的底部修剪成一条直线。在凝胶底部做同样的操作,修剪掉多余的凝胶“L”,形成一条平坦的水平线。

3.使用方形耐热玻璃盘子,将塑料转移盒黑色的一面朝下,加入1x 转移缓冲液。浸泡两块泡沫海绵,一块铺在黑色的一面,在泡沫上面铺一张滤纸,确保两者都是湿润的,并稍微浸入水中。轻轻地将凝胶向下放置在湿滤纸上,凝胶的顶部朝向传递盒封口的顶部。用1x转移缓冲液湿润切开的硝化纤维素膜,通过摇动确保其完全湿润(外观均匀)。在浸入水中时,将硝化纤维素放在凝胶的顶部,确保凝胶和膜之间没有气泡,保持原位,加入湿滤纸,然后在浸入转移缓冲液时用泡沫海绵制作三明治。关闭转移卡带并夹紧。

4.将转印卡带放入红/黑转印卡带中,将每个卡带的黑面与转印卡带的黑面相匹配。

5.将冷却冰袋放入转移壳旁边的水箱中。

6.从耐热玻璃培养皿中取出1倍的转移缓冲液,填满水箱(必要时增加更多,使水箱完全填满顶部,覆盖转移外壳)。

7.将储罐置于耐热玻璃皿中,盖上盖子,并将红色和黑色电缆与探头相匹配,连接到电源上。

8.打开100 V恒定的电源组,传输1小时。

9.跑完后,取下传送卡带,打开三明治。将凝胶表面的硝化棉剥开,在硝化棉的右上角开一个小缺口,使膜的正面和凝胶的顶部定向。膜的表面和顶部将始终以右上方的缺口为方向。颜色标记应该作为分离质量和蛋白质向膜转移的视觉度量。

10.将膜放入1 × TBST的方形培养皿中,置于摇板上。

3.3 免疫检测 

1.将膜在 1× TBST 中摇洗3 次,每次5分钟。

2.将 10%脱脂牛奶(NFDM)溶解在TBST中搅拌。

3.在 10% NFDM中印迹,在室温下摇育>30分钟。

4.将膜在 1× TBST中摇洗 3次 5分钟。

5.用平钳将膜转移到新鲜的培养皿或热封袋中,加入一抗,室温摇床孵育≥3 小时。也可选择 4°C 过夜孵育。一抗的最佳浓度应通过稀释系列经验确定。

6.将膜在 1× TBST 中摇洗3 次,每次5分钟。

7.在新鲜培养皿中加入酶标二抗,室温摇培养>1 h +。通常使用浓度为 1 μg/ mL 的二抗,但这可以通过稀释系列进行经验优化。

8.将膜在 1× TBST 中摇洗3× 5分钟。

9.在使用前将 A 和 B溶液 1:1 混合,准备足够的 picoECL SuperSignal底物,以覆盖膜。注意不要交叉污染 A和 B原液。

10.膜在 ECL底物中摇培养5分钟。

11.将膜置于透明的聚碳酸酯塑料片(透明片保护剂)之间,并用黑色记号笔,用两根刻度标记红色蛋白质在梯子中每个蛋白质 的位置。 12. 移动到成像设备,调整成像仪聚焦于膜边缘,关闭暗室门,在 10 秒、30 秒、1 分钟、2 分钟、5 分钟采集图像,保存为 TIFF 文件,并对最佳图像进行标注,标注样品细节和免疫印迹条件。

 

本篇文章可供科研爱好者参考。它不能代替需要更详细和专业信息的专业知识或实践实验程序。如果有任何内容侵权,请联系作者立即删除有争议的材料。