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Plodia飞蛾隐性白眼突变的定位和同源定向修复

2022-02-24 阅读(836)

Plodia飞蛾隐性白眼突变的定位和 CRISPR 同源定向修复

 

Plodia interpunctella在全世界都是是储存食品的害虫,也是鳞翅目动物功能基因组学的一个有前途的实验室模型系统。在这里,我们描述了对这种昆虫进行精确基因组编辑的有效方法。一个自发的隐性白眼表型映射到白色基因中的一个帧移缺失(c.737delC)。白色基因的CRISPR NHEJ诱变复制了这种表型,体细胞双等位基因敲除率高。两只眼睛都有突变克隆的G0个体产生了100%的突变后代,使白色成为一个 在靶向其他基因时,白色是一个理想的共同转换标记。CRISPR HDR实验 纠正了c.737delC,并使37%的G0马赛克成体中的白眼恢复到色素状态。这些修复的等位基因在回交中显示了实际的种系传递率。证明了该技术在精确基因组编辑方面的潜力。Plodia提供了一个 由于其可在实验室中使用的特点、卵子的可注射性和可编辑性,为该类群的研究提供了一条很有前途的途径。

结论

色素位点已被普遍用于昆虫中,作为各种表型标记。由于它们在幼虫阶段的身体颜色和在成虫阶段的眼睛颜色容易区分。在第一次努力 在首次使用CRISPR/Cas9研究敲除Plodia的眼色基因时,白色基因座的第一外显子被作为目标,以产生 白色基因座的第一外显子被作为目标,以产生一个可遗传的无效突变。在此,我们研究了 在此,我们通过全基因组测序,研究了在Plodia中自发的眼色突变表型的遗传基础,并展示了成功的工作流程。测序,并展示了一个成功的工作流程,通过精确的 基因组编辑。具体来说,CRISPR介导的NHEJ敲除白色的结果是以相对较高的效率进行双亲体细胞编辑和种系传递。最后,我们表明 用ssODN供体的HDR基因敲入有效地纠正了一个1bp的缺失,导致隐性白眼。白眼病,同样具有很高的效率。这些数据,加上精简和安全的饲养程序 奠定了进一步利用Plodia进行功能基因组学研究的基础。

我们提出,白眼Pi_Fog w-/-的脱色使其成为添加显性标记的理想选择,如由已知在Plodia中起作用的3xP3眼睛和胶质启动子驱动的荧光蛋白。野生型Pi_Fog可用于CRISPR实验,其中白色基因敲除的sgRNA被共同注入,以选择具有大克隆的创始者,这种共同转换策略已在果蝇中使用。事实上,我们的基因敲除数据表明,100%(N=15)的G0创始者由于双等位基因敲除而具有双侧非镶嵌式白眼,产生100%的后代(N=1177)。换句话说,白眼表型为识别携带种系编辑的创始者提供了一个合适的标记,我们建议这种共转化策略将有助于建立稳定的基因组编辑品系,因为那里很难筛选表型。Pi_Dun基因组参考文献可以在NCBI Assembly服务器上以Pi_dt的名义随时在线访问,方便实验设计。sgRNA设计中的其他考虑可以进一步促进基因组编辑。首先,瞄准一个与限制性位点重叠的序列可以使基因分型 直接了当。其次,一些报告表明,Cas9的活性得到了改善 终止于G-3'或GG-3'的sgRNA设计可以提高Cas9的活性。最后,在这篇文章中,一个实验者能够在产蛋后不到60分钟内注射数百个鸡蛋。产蛋后60分钟(AEL),在2-3小时的注射时间。值得注意的是,两个 值得注意的是,两个实验者,一个收集和排列鸡蛋,另一个注射和密封鸡蛋,可以在产蛋后25分钟内注射鸡蛋。可以在产蛋后25分钟内注射卵子,这应该可以减少马赛克现象,并在需要时进一步提高 如果需要的话,这应该可以减少马赛克,并进一步提高种系传播率。

我们对隐性白细胞c.737delC突变的CRISPR显性拯救揭示了高效的基于HDR的单碱基对编辑,表明ssODN供体可被常规用于在Plodia基因组中引入小的无痕编辑。在这种应用中,一般推荐使用30 nt到90 nt的同源臂的不对称设计,并且由于该技术可能导致不完美的修复,所以对编辑的验证是必要的。在这篇文章中,我们基于之前在哺乳动物细胞系中进行的单碱基替换的优化设计,使用位于PAM序列5'侧或附近的ssODN,与sgRNA链互补,长度约为75-85 nt,两边有30-40 nt的同源物。根据这些发现,我们的76 nt修复模板被设计成与非目标链有40 nt的左同源臂和33 nt的右同源臂,在距离切割点4 nt处有一个点突变(C插入),以及一个2nt的沉默突变(CTC>TTG Leu密码子)以防止二次切割。由于WT(获救)等位基因是显性的,我们用回交的方式与w -/-回交,并计算G1获救个体的数量,作为估计嵌合体创始人中生殖细胞编辑比例的代理。在37.5%的G0个体中,我们可以检测到眼睛中的体细胞修复,在496个G1后代中,有24.4%的个体显示了来自精确HDR的拯救等位基因。这个实验的注射是在15-60分钟AEL进行的。如前所述,两个实验者在25分钟内进行注射,可能会限制体细胞和生殖细胞的镶嵌,并提高编辑率。优势拯救实验表明CRISPR方法可以在Plodia中以相对较高的效率进行精确的种系编辑,我们鼓励使用和开发类似的方法,在此基础上进行有针对性的遗传转化。我们鼓励在这个系统中使用和开发类似的方法进行有针对性的遗传转化。原文链接:www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(22)00155-9

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