做过PCR的童鞋们都知道要想完全hold该实验、成为真正的PCR达人，并非易事。就qPCR而言，似乎其中的每一环节都可以让整个实验挂掉，也因此成为了资深科研狗们心中的痛。有时，各种假阳性、非特异性带等问题就是挥之不去、不请自来，这个时候该如何是好呢？实践出真知，小编就将各位前辈用经验换来的真理分享给大家。

　　Q1：PCR产物出现假阳性（即空白对照出现目的扩增产物）

　　Answer：

　　1、引物设计不合适：扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可扩增出非靶序列的序列；靶序列太短或引物太短，可导致假阳性。此时需重新设计引物。

　　2、为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂及器材应高温灭菌，所有离心管及加样枪头等均应一次性使用；必要时，加样前反应管和试剂均用紫外线照射，以破坏存在的核酸；

　　3、为了避免靶基因受到空气中小片段核酸（与靶序列具有一定同源性）污染，可用巣式PCR方法减轻或消除。

　　Q2:PCR产物中出现假阴性或无扩增产物（即阳性对照中有条带，而样品则无条带）

　　Answer:

　　1、条带放置时间过久,核酸被降解，最好在48h内进行电泳检测。

　　2、DNA模板纯度低，如含有杂蛋白质或Taq酶抑制剂，可对DNA进行再次纯化或重新用优质试剂盒提取DNA; DNA浓度太低时，可以加大模板量；对具有二级结构DNA使用较好的聚合酶；提取DNA时，避免吸入酚类试剂。

　　3、对设计不合理的引物进行重新设计合成；引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融而降解失效；检测引物OD值并进行电泳检测以确保两条引物浓度一致。

　　4、酶失活时，更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

　　5、PCR反应条件：提高变性/退火温度；适当增加循环次数。

　　6、Mg2+浓度过低可影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，而Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性，因而可适当提高Mg2+浓度。

　　7、如果靶序列发生突变或缺失时，也会影响引物和模板的特异性结合，产生假阴性结果。

　　Q3：非特异性条带扩增或者条带出现拖尾现象

　　Answer：

　　1、当引物特异性差或引物形成二聚体时，可重新设计引物或者使用巣式PCR

　　2、若模板或引物浓度过高，可适当降低模板或引物浓度

　　3、酶量过多，则适当减少酶量

　　4、Mg2+浓度偏高，则降低镁离子浓度

　　5、退火温度偏低，适当提高退火温度或使用二阶段温度法（94变性，65左右退火与延伸）

　　6、循环次数过多，不仅会降低扩增效率，且会使错误掺入率增加，因此需要减少循环次数。

　　Q4：提高PCR特异性的策略有哪些？

　　Answer:

　　四种策略：

　　1、巣式PCR（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的灵敏度；降低了扩增多个靶位点的可能性；提高PCR特异性

　　2、递减PCR（Touch Down PCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性；循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2，直到退火温度低于Tm 5 。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。

　　3、热启动PCR：抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪到达变性温度。如在冰上配制PCR反应液以抑制Taq酶活性，后将其置于预热的PCR仪中。

　　4、使用PCR增强剂：甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等可以降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。但是增强剂的浓度要适当。

　　Q5: PCR引物设计的一般原则是什么？

　　Answer：

　　1、引物长度：15-30bp,一般为20bp左右。

　　2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。上下游引物的GC含量不能相差太大。A/T/C/G最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　3、引物结构：避免引物3’端出现互补序列及二级结构，3’端的碱基特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对。

　　4、引物中酶切位点一般加在5’端，合适的酶切位点便于后续实验中的酶切分析或分子克隆。

　　5、引物浓度：每条引物浓度0.1-1umol或10-100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物间二聚体的形成机会。

　　Q6：克隆PCR产物的最优条件是什么？

　　Answer:

　　目的片段与载体的最佳比例需依照实验来确定，一般1:1为最佳比，摩尔数比为1:8或8:1也行。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶及目的片段共10ul。室温保温1小时，或4过夜（可提高链接效率）。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。

　　Q7：PCR产物是否需要凝胶纯化？

　　Answer:

　　如凝胶分析扩增产物中只有一条带，则无需凝胶纯化。若是有大量的引物二聚体，则需在克隆前进行凝胶纯化。

　　Q8：没有回收到目的片段，需要做什么对照实验？

　　Answer:

　　1、涂布未转化的感受态细胞，如有菌落，表明氨苄霉素失效，或有氨苄抗性的杂菌污染。

　　2、转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。转化率=产生菌落的总数/铺板DNA总量，铺板DNA总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。例如将1ul的质粒（1ug/ul）用于100ul感受态细胞转化。再将1ul转化后的感受态细胞稀释至1000ul后（含有10ng DNA），用100ul铺板（含有1ng DNA）。过夜培养后得到了1000个菌落。转化率=1000菌落数×103ng/铺板1ng DNA=106 cfu/ug。低于108cfu/ug，转化效率低，应重新进行细胞转化。

　　3、如用pGEM-T作为阳性对照，产生了超过20-40个蓝斑，表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶，需更换核酸酶。

　　Q9：对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

　　Answer:

　　1、目的片段不适合连接。因用凝胶纯化的目的片段在受到UV过度照射时会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必须重新纯化。

　　2、如PCR反应体系的DNA聚合酶若带有修复功能，则扩增产物末端无碱基A（该碱基是pGEM-T载体克隆所需的）。可将酶更换为Taq DNA聚合酶。

　　3、高度重复序列可能会不稳定，在PCR扩增中产生缺失和重排。如若目的片段高频率的产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞。

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