Q1：如何提高qPCR反应的灵敏度与特异性？

　　Answer:

　　1、首先确定模板RNA完整性好，无DNA污染。

　　2、RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂

　　3、为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。

　　4、使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。

　　5、若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。

　　6、设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。

　　Q2：避免RNA降解的方法有哪些？

　　Answer:

　　1、在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA

　　2、使用良好无污染技术分离RNA

　　3、将组织从动物体取出后立刻提取RNA，并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。

　　Q3:RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？

　　Answer:

　　逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，可将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检测RNA抑制剂；若对照RNA与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗，以除去抑制剂。

　　Q4：如何解决合成cDNA第一链合成的引物退火不充分？

　　Answer:

　　确定退火温度适合实验中所用的引物。如随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25保温10min。

　　Q5：如何减少RNA模板中的二级结构？

　　Answer:

　　1、将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火；提高逆转录反应温度。

　　2、温度超过60时，不能使用oligo（dT）引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP

　　3、RT-PCR产物的长度超过1kb时，反应温度需保持在65。

　　Q6：RNA中有DNA污染的处理方式

　　Answer：

　　1、若是基因组DNA的污染，可使用DNaseI处理RNA; 同时设置没有逆转录的对照组反应检测DNA污染。

　　2、若是受到外源DNA的污染，可使用抗气雾剂和UDG酶。

　　Q7：qPCR探针设计的一般原则有哪些？

　　Answer:

　　1、扩增片段的长度不应太大，一般小于300bp。

　　2、探针不能和任一引物互补，且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短，长度不要超过30bp。

　　3、探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度

　　4、探针如用于检测多态位点，多态位点应尽可能靠近探针中部

　　5、探针5’端不能是碱基G，G对荧光基团有猝灭作用。

　　Q8：在无反转录酶的情况下，对照RNA仍获得扩增结果

　　Answer：

　　1、体外转录时不可能将所有DNA模板消除，因而对照组会含有痕量的DNA。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影响。

　　2、可能是引物二聚体的条带。

　　Q9：扩增产物滞留在加样孔中

　　Answer：

　　1、可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链cDNA浓度稀释至100倍再进行二次扩增。

　　2、在二次PCR时，使用的退火温度如果比引物的Tm值低5，可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

　　Q10：无Ct信号出现

　　Answer：

　　1、反应循环参数不够，一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值。

　　2、检测荧光信号的步骤有误。SYBRgreen法（SG法）采用的是72延伸时采集荧光信号，taqman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。

　　3、引物或探针降解，可用PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针。

　　4、模板不足或降解，则可以重新提取核酸模板。

　　Q11：Ct值出现过晚（Ct>38）

　　Answer：

　　1、扩增效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，增加镁离子浓度。

　　2、反应成分降解或加样量不足

　　3、PCR产物过长，一般采用80-150bp.

　　Q12：标准曲线线性关系不佳

　　Answer：

　　1、加样存在误差，是样品浓度不成梯度。

　　2、标准品出现降解，避免反复冻融。

　　3、引物或者探针设计不佳。

　　4、模板中存在抑制物或模板浓度过高。

　　Q13：溶解曲线存在多个主峰

　　Answer：

　　1、引物设计不够优化。

　　2、引物浓度不佳，上下游引物浓度比例不一致。

　　3、镁离子浓度过高。

　　4、模板基因组的污染。

　　Q14：同一样品中，其中某一个荧光信号特别强。

　　Answer:

　　1、试剂配制时反应液没有完全溶化，导致探针量在一管增多。

　　2、试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。

　　3、PCR仪热槽被荧光物质污染，需要清除热槽中的污染。

　　Q15：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？

　　Answer：

　　1、反应过程中电压不稳定

　　2、可能在20个循环左右时，仪器有停下或仪器有开盖，使光线突然增强

　　3、如果尖峰向下，可能是由卤素灯老化所致，这时应更换。

　　Q16：部分样本扩增效率过低？

　　Answer:

　　1、提取液残留，一定程度抑制了PCR反应

　　2、反应液未严格取量混匀或分装不均匀

　　3、试剂失效

　　Q17：阴性对照或空白对照翘尾

　　Answer：

　　1、模板提取环境或操作过程有污染

　　2、配液过程存在污染

　　Q18：直线型扩增曲线

　　Answer：

　　1、探针部分降解：一般稀释的探针可在4°C保存至少3个月，探针的反复冻融或导致降解；或者探针在光线下暴露时间太长了。

　　2、反应液中有PCR抑制物。

　　Q19：没有扩增曲线

　　Answer：

　　1、PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段

　　2、电脑设定了自动休眠

　　Q20：基线下滑

　　Answer：

　　基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致。

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