G蛋白偶联受体（GPCRs）是被批准的药物最常见的靶蛋白。对GPCR激活机制的大规模构象转换进行完整的机理阐释，对治疗性药物的开发至关重要。在这里，我们应用一个综合的计算和实验框架，整合了大量的分子动力学模拟、马尔可夫状态模型、定点诱变和构象生物传感器，研究血管紧张素II（AngII）1型受体（AT1受体）的构象--一个典型的A类GPCR激活。我们的研究结果表明，AT1受体的激活有一个协同的过渡机制。在激活途径中确定了一个关键的中间状态，它在受体的细胞内区域拥有一个隐秘的结合位点。这个隐性位点的突变阻止了内源性AngII八肽激活剂对下游G蛋白信号传导和 β-arrestin介导的途径的激活。这些发现共同提供了在原子水平上对AT1受体激活的更深理解，并提出了设计异生AT1受体调节剂的途径，在GPCR生物学、生物物理学和药物化学方面有广泛的应用。

结论

GPCRs作为治疗感觉、循环和中枢神经系统疾病的治疗靶点，已经得到越来越多的关注。尽管进行了深入的研究并积累了大量的结构和功能数据，但要完全理解GPCR的激活机制，阐明能够采取一系列不同构象来调节多种下游信号传导途径（称为偏向性信号传导）的复杂信号传导机制，以及设计能够区分密切相关的受体亚型的小分子异生调节剂，仍然是一个挑战。作为GPCR研究的典型模型系统，AT1受体不仅通过调节其内源性配体AngII显示出偏向性信号，而且还显示出作为治疗高血压的目标的巨大前景。最近，拮抗剂结合（非活性）、AngII结合和偏向激动剂结合（活性）的AT1受体结构已被确定；然而，受体激活的动态过程及其通过构象选择机制的偏向信号传递仍未被完全了解。

在本研究中，我们对AT1受体进行了广泛的MD模拟（300μs），并使用NEB方法来定义从非活性状态到活性状态的途径。通过参考常见的GPCR激活特性，MSM确定并确认了自由能景观。MSM提取了非活性、中间状态和活性状态的代表性构象；因此，通过比较这些构象并确认中间状态的存在，提出了一种协同激活机制。然后，应用tICA分析全局运动，并确定了不同的活性状态，这为揭示由G蛋白或 β-arrestins介导的偏向信号通路提供了提示。未来的核磁共振实验可能会进一步确认AT1受体的大状态和偏向性信号传导。在TM7和H8之间，在中间状态下发现了一个隐秘的异生位点，并通过位点定向诱变和生物传感器得到证实。累积起来，我们的模拟和实验对现有的知识做出了重大贡献，因为它提供了对AT1受体激活机制的见解，并报告了一个变构袋。

一般来说，AT1受体的激活机制与其他A类GPCRs相似。在激活过程中，TM6向外移动，为换能器提供空间，TM5和TM7接近，形成口袋。值得注意的是，H8经历了一个向上的运动，在转变过程中形成了一个隐秘的异生部位。然而，在激活时，AT1受体由于其特殊的残基组成而具有其他几个独特的特性。例如，R^3.50和N^6.30显示出弱的极性相互作用，而不是其他GPCRs中观察到的强离子锁，这有利于TM6的构象重排以与下游效应物接触，增加apo组合中活性构象的比例。这可能导致相对较高的组成活性。有趣的是，Y^7.53和Y^5.58的接近促进了活性状态的形成，这是AT1受体特有的。因此，AT1受体不仅有一个共同的激活机制，而且还通过特定残基的移动保持其独特性。

值得注意的是，在apo AT1受体中自然存在中间状态和活性状态。这种群体分布已经在其他apo GPCRs中被证明是基础活性的手段。因此，激动剂选择并稳定GPCRs的活性构象，并促进转导剂的结合。一旦换能器与GPCRs结合，活性构象就具有较低的能量，此后完全稳定了活性状态，并证明了GPCR激活的构象选择机制。活跃的AT1受体显示出两种不同的构象，正如tICA所确定的那样，因此支持这样的假设：Gq结合的和 β-arrestin 2结合的活跃构象都存在于AT1受体的组合中。这两种构象分别被Gq和 β-arrestin 2偏向性激动剂所稳定，表明偏向性信号传递中存在一个群体转移机制。相比之下，平衡激动剂同样稳定了两种构象，因此导致下游蛋白没有偏好。因此，偏向性信号传导的出现是通过构象选择机制进行的。换句话说，GPCR活性的调节归因于普遍的异生调节；因此，设计针对异生位点的调节剂是很自然的，而不是针对内源性的正生位点。

在中间状态，我们发现P6是一个异生调节的部位。P6隐藏在TM7和H8之间，只在H8向上运动时被观察到。群体分析表明，H8和其他部位之间的信号传递受阻，阻碍了活性构象的形成。诱变实验进一步证实，P6周围的残基传递的信号既能调控G蛋白，也能调控 β-arrestin，并表明来自P6的异生扰动有可能调控AT1受体的活性。目前有几个GPCRs缺乏内源性配体的特征来启动特定的偏向性信号。因此，通过异体调节剂直接靶向细胞内TMs（如P6）可能提供一种选择性调节GPCRs的策略。特别是，作为一个未被利用的异生作用部位，P6可以成为未来GPCRs异生作用药物设计的目标。为了充分实现P6作为GPCRs的异生作用靶点，将进一步部署基于结构的药物设计方法和实验调查，以发现先导化合物。这些研究不仅有望提供对AT1受体激活机制的见解，而且还能为GPCR生物学、生物物理学和药物化学提供多功能的应用。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-25020-9

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