服务热线
400-621-6806

周一至周六

8:00-18:00

在线客服
销售支持二维码
 

ChIP实验问题解答

2023-11-07 阅读(173)

ChIP,全称的意思是染色质免疫共沉淀——换种说法,就是我们用抗体去“钓”特定的能结合DNA的蛋白质,我们最后检测的是和这蛋白质结合的DNA。

 

1. 为什么要用甲醛交联?

 

甲醛交联是 ChIP 实验非常关键的一个步骤。因为甲醛交联能更好的保存蛋白与 DNA 的相互作用,除了用于检测组蛋白修饰分布的 Native ChIP 以外,其他的 ChIP 基本上都需要用甲醛交联。

甲醛作为交联剂有几个好处:(1)甲醛是一种非常活跃的小分子,它本身可以非常容易的穿过细胞膜及核膜进入细胞核,并通过醛基将 DNA 碱基上的氨基/亚氨基与蛋白的碱性氨基酸上的氨基/亚氨基交联。(2)甲醛的交联是可逆反应,可以通过加热的方式解除交联,从而方便后续的 DNA 分析。

 

2. 甲醛交联有什么注意事项:

 

(1)甲醛交联用到的甲醛浓度和交联时间都是有严格要求的。一般的甲醛交联都选用1% 的甲醛浓度,室温固定10~15分钟。时间太短的话,交联反应进行的不彻底,很多蛋白与 DNA 的结合不是很牢固,交联时间太长的话,会导致后续超声非常困难,而增加超声时间或功率会破坏目的蛋白本身的结构,进而导致 ChIP 结果不理想。

(2)在甲醛交联之前,细胞需要尽可能少被人为处理。如果条件允许的话,直接将甲醛加入培养基或将细胞培养基吸弃并换成含有1% 甲醛的 PBS 交联会比胰酶消化细胞以后再交联更好一些。

(3)甲醛交联反应结束之后,需要马上加入相对甲醛过量的甘氨酸(一般甘氨酸终浓度为125 mM)与甲醛反应,终止交联反应。

(4)终止交联之后,样本需要经过 PBS 清洗(如果细胞数量比较少的话,可以在 PBS 里加入0.1%~0.5% NP-40,这样细胞在转移时不会粘在管壁或培养皿上),细胞沉淀可以直接用液氮速冻,然后置于-80 摄氏度长期保存。

(5)组织的交联相比细胞交联要复杂一些。虽然甲醛可以很容易的透过细胞,但是大的组织块还是不太容易交联的很均一,所以大的组织块交联之前需要切成小块。一般建议用两个刀片将组织块切成 1~3 mm3 大小。组织的交联时间一般可以延长到15 min,这样能保证组织的充分交联。

 

3. 染色质片段化大小有什么要求

 

不管是用超声还是酶切,染色质片段化大小是 ChIP 实验的一个关键点。以超声为例,打断后的 DNA 片段大小以 200~1 000bp 为宜。DNA 片段太大,一方面影响 IP 效率,更重要的是会影响 ChIP 的分辨率。DNA 片段太小虽然理论上能得到更高的分辨率,但也会影响后续的 qPCR 和建库。另外,需要注意的是,超声是通过物理的作用力将 DNA 的共价键打断,从而实现染色质片段化。其在破碎 DNA 的同时,也会在一定程度上破坏目的蛋白以及目的蛋白和 DNA 之间的相互作用。所以,超声摸索应遵循适可而止的原则。

除超声仪外,样品制备本身有三个因素会对超声效果产生影响:

(1)超声用的 buffer。这其中尤其以 SDS 的影响最大,SDS 浓度越高,DNA 越容易被打断。同时盐离子和其他去垢剂浓度都会对超声产生一定影响,一般认为盐离子或去垢剂浓度越高,DNA 越容易被打断。

(2)细胞密度。超声时的细胞密度越高,DNA 越不容易被打断。所以建议细胞密度应小于107/ml 裂解液。

(3)细胞类型。不同细胞类型间,超声效果差异也很大。相对于常用的肿瘤细胞系,很多原代培养的细胞以及组织细胞的染色质超声破碎会更困难些。

 

4. 抗体有什么要求

 

超声之后的 IP 过程是 ChIP 成功与否的关键。这其中有两个因素是比较重要的:首先是抗体。ChIP 实验首先需要选用 ChIP 级的抗体。

这个抗体需要满足几点要求:

(1) 识别目的蛋白的立体表位。这跟做 Western Blot 的抗体是有区别的,因为 WB 的抗体识别的是蛋白的变性表位。

(2) 识别甲醛交联后的立体表位。这跟做 IP 的抗体是有区别的。因为 ChIP 相对于 IP 需要甲醛交联的过程,甲醛会在 DNA 和蛋白质,以及蛋白和蛋白的氨基/亚氨基之间形成共价键,所以 ChIP 级的抗体还要识别甲醛交联后的目的蛋白。这跟免疫荧光的抗体有点类似。

(3) ChIP 级的抗体跟目的蛋白有足够强的相互作用,能够耐受高盐,低盐及多种去垢剂(比如 0.1% SDS,1% Triton X-100 或 NP-40)的清洗。所以选择抗体时,最好选择文献报道可以用于 ChIP 实验的抗体,或抗体公司提供 ChIP-qPCR 或 ChIP-seq 数据的抗体。

 

5. buffer有什么要求

 

IP 的另外一个关键因素是 buffer,这包括 binding buffer(超声用 buffer)和 wash buffer。一般来说,选用的 Buffer 越剧烈,背景 DNA 去除的就会越干净,但同样的,目的 DNA 也会被更多的清洗掉。反之,选用的 buffer 越温和,目的 DNA 得到的就会越多,但同样的,背景 DNA 也就残留的越多。对于去垢剂来说,离子型去垢剂(如 SDS,SDC)比非离子型去垢剂剧烈得多。对于盐来说,剧烈程度 LiCl > NaCl > KCl。去垢剂的选择,盐和去垢剂的浓度都会对 ChIP 效果产生很大影响。很多实验室或公司在这方面都有自己独到的 buffer 配方。

 

6. 可以从那些方面进行实验优化

 

为了降低背景,很多实验会在两个地方做优化:

(1) 在超声破碎之前,首先破碎胞浆,通过离心将胞浆胞核分离,去除胞浆蛋白,降低胞浆蛋白干扰

(2) 用超声后的染色质与 protein A/G beads 预孵育,在去除 beads 之后再加入鲑精 DNA 预封闭过的 protein A/G beads 和目的蛋白抗体进行孵育。

 

本篇文章可供科研爱好者参考。它不能代替需要更详细和专业信息的专业知识或实践实验程序。如果有任何内容侵权,请联系作者立即删除有争议的材料。