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ChIP实验简介

2023-11-07 阅读(146)

一、ChIP实验的作用

 

染色质免疫沉淀(ChIP)是研究体内蛋白质-DNA相互作用的一种有价值的方法,鉴定各种DNA相互作用蛋白(如转录因子和调节因子、修饰组蛋白和表观遗传修饰因子)的结合位点和模式是必不可少的。来自组织或培养细胞的交联(XChIP)或天然(NChIP)染色质是碎片化的,目的蛋白质使用特异性抗体进行免疫沉淀,然后纯化共沉淀的DNA,并通过区域特异性PCR、DNA微阵列(ChIP-on-chip)或下一代测序(ChIP-seq)进行分析。因此,该分析可以产生有关被分析蛋白在特定候选位点或整个基因组中的定位信息。

染色质免疫沉淀(ChIP)的目的是分析体内蛋白质或蛋白质复合物与染色体DNA的相互作用。该方法通过表征染色体蛋白与特定基因组靶点的关联,允许在其自然背景下动态可视化染色体蛋白。为此,将感兴趣的生物材料在体内用甲醛固定,细胞被裂解,染色质被切割和溶解。固定保存了大分子(DNA与蛋白质和/或蛋白质与蛋白质)之间的联系,否则这些联系将在细胞裂解过程中丢失或受到干扰,特别是在染色质剪切过程中。所得的染色质悬浮液用针对目标蛋白的抗体进行免疫沉淀,并对免疫沉淀的DNA片段进行分析。如果所研究的蛋白质与体内的特异性基因组区域,该区域的DNA片段在免疫沉淀物中应该是富集的。原则上,这种方法可以应用于任何染色体蛋白,唯一的先决条件是存在高度特异性的抗体。

 

二、ChIP实验的应用

 

在1993年发表的一篇开创性论文中,Polycomb(PC)是第一个通过ChIP定位到基因组区域的蛋白质,使用的是果蝇培养细胞。后来,ChIP技术被应用于多种生物系统,如酵母、四膜虫、小鼠组织培养细胞和胚胎、各种人类组织培养细胞和植物组织,以绘制多种蛋白质,包括几种Polycomb组(PcG)成员。

为了进行ChIP分析,细胞或组织用甲醛固定一段时间(XChIP)。甲醛是一种活性很强的物质,通过其亲核核心与蛋白质的氨基和亚胺基(例如赖氨酸的ε-氨基)和DNA(腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤的侧链)相互作用。固定不需要特殊条件,因为甲醛是一种小的水溶性分子,很容易穿透生物膜。因此,固定可以在体内完成,方法是将浓缩的原液直接添加到悬浮在标准缓冲体系中的活组织中,或者直接添加到培养细胞的培养基中。然而,重要的是要避免含有Tris等缓冲液,因为甲醛也会与这些反应,导致不完全固定。甲醛交联步骤是该方案中最经验性的部分。人们对它的特异性和效率知之甚少,而且对于所分析的每种蛋白质,交联条件可能会有所不同,需要进行优化。对于一些蛋白质和染色质组分,交联和ChIP分析是困难的,甚至是不可能的。据报道,甲醛处理也会引起染色质组成本身的变化,这可能导致ChIP效率降低。酵母中,高表达基因似乎容易受到免疫沉淀蛋白非特异性富集的影响。因此,如上所述,通过独立实验确认使用XChIP发现的任何相互作用的生物学相关性非常重要。

通过添加甘氨酸来停止交联反应,甘氨酸提供了过量的氨基,从而终止固定。然后将细胞溶解在含有生理盐浓度和洗涤剂NP40的缓冲液中。这一步去除细胞质和膜蛋白,穿孔核膜,并洗涤染色质以去除非交联蛋白。这取决于起始材料和细胞类型。最后,将细胞核制成球团,然后在含有高(0.8-1%)浓度的洗涤剂十二烷基硫酸钠(SDS)的小体积裂解缓冲液中重悬,以诱导细胞核完全裂解。此外,SDS有助于在下一步有效地剪切DNA。裂解后,通过超声获得可溶性染色质悬浮液。这是一种非常有效的方法,可以将染色质切割成长度为0.3-1kb的易于沉淀的片段。DNA片段越短,最终蛋白质定位的分辨率越高。ChIP方法采用了类似的DNA剪切方法,完全省略了交联步骤。在天然染色质IP连接中,细胞在没有事先交联的情况下均质,染色质被微球菌核酸酶消化到单核小体分辨率。然后将这种天然染色质制剂直接用于IP,并分析共纯化的DNA。

NChIP方法已成功用于组蛋白修饰的分析。其优点是由于更高的抗体特异性,具有更好的染色质和蛋白质回收率。然而,它大多不适用于非染色质组分,如转录因子、调节因子或抑制蛋白(包括PcG成员),因为它们与DNA的相互作用不够稳定,无法在没有交联的情况下存活下来。超声处理后,染色质溶液通过离心清除碎片和不溶性物质。必须非常小心地去除所有不溶性物质。任何残留的污染都可以在免疫沉淀的后续步骤中形成颗粒,从而在剩余的实验过程中进行,可能会产生假阳性结果。免疫沉淀和洗涤过程中的缓冲液组成决定了分析的严格性。在核裂解缓冲液中,SDS的洗涤剂浓度通常太高,无法使抗体和表位之间有效地相互作用。因此必须稀释溶液以降低SDS浓度。此外,在此步骤中盐浓度增加,使整个溶液达到IP缓冲条件。

 

卡梅德生物(KMD Bioscience)多年来致力于蛋白与核酸互作关系的研究。真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。卡梅德生物建立了成熟完善的抗体平台、蛋白平台等各种技术平台,拥有完备的蛋白检测设备,同时卡梅德生物拥有丰富的重组标签蛋白表达经验,能够在原核和真核表达系统为客户表达带有GST,Myc-tag,Flag-tag,HA-tag等标签的重组蛋白。利用这些标签蛋白特异性的抗体,卡梅德生物能够为客户提供染色质免疫共沉淀技术(ChIP共沉淀服务)。

 

 

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