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CRISPR-Cas9错配监测的结构基础

2022-03-11 阅读(940)

CRISPR–Cas9 作为一种可编程基因组编辑工具受到脱靶 DNA 切割的阻碍,并且 Cas9 识别错配的潜在机制知之甚少。尽管已经设计出对错配具有更大辨别力的 Cas9 变体,但这些变体的目标 DNA 切割率大大降低5 , 11. 在这里,我们使用动力学引导的低温电子显微镜来确定 Cas9 在错配切割不同阶段的结构。我们观察到在存在错配的情况下形成的引导 RNA-DNA 双链体的独特线性构象,这阻止了 Cas9 的激活。尽管典型的扭结引导 RNA-DNA 双链体构象有助于 DNA 切割,但我们观察到含有远离原型间隔区相邻基序的错配的底物通过重组 RuvC 结构域中的环而得到稳定。错配稳定残基的诱变减少了脱靶 DNA 切割,但保持了快速的靶向 DNA 切割。通过针对仅涉及错配耐受性的区域,我们为下一代高保真 Cas9 变体的设计提供了概念验证。

对于 CRISPR–Cas9 的治疗应用,必须尽量减少脱靶 DNA 切割。尽管已经开发了多种具有改进错配辨别能力的高保真 Cas9 变体但它们增强的特异性是以严重降低目标 DNA 切割为代价的。错配诱导替代 Cas9 构象;然而,用于指导对此类变体进行合理重新设计的结构与目标 DNA 和非活性构象结合. 为了了解控制脱靶识别的分子机制,我们在这里使用动力学分析来指导低温电子显微镜 (cryo-EM) 的样品制备,并在各种指导 RNA 存在下获得了 Cas9 预切割激活中间体的结构快照—— DNA 靶链 (gRNA-TS) 错配。

结论

通过动力学指导的结构测定,我们描述了在 Cas9 激活之前的 gRNA-TS 双链体构象中间体(图)。值得注意的是,我们观察到在极端PAM远端(位置18-20) 归因于一种独特的机制,该机制稳定了高度扭曲的双链体构象,涉及 RuvC 中穿透双链体的域环。该区域在先前确定的 Cas9 结构中缺失,这表明它仅在这些位置的错配耐受中起作用。我们的研究结果提供了对控制 Cas9 脱靶效应的潜在结构机制的分子见解,并为设计下一代高保真 Cas9 变体提供了分子蓝图,这些变体可减少脱靶 DNA 切割,同时保持有效切割目标 DNA。

 

 

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41586-022-04470-1

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