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骆驼免疫VHH抗体文库构建服务

 

 

 

卡梅德生物科技(KMD BioscienceTM)能够为客户提供高质量的,基于M13噬菌体展示的驼源抗体筛选服务,包括双峰驼和单峰驼(羊驼)来源的纳米抗体噬菌体展示技术服务。我们的科学家拥有多年的重链抗体(Vhh抗体)文库展示构建,筛选经验,能够在较短的时间周期内获得高品质的纳米抗体。

 

驼源抗体文库制备-重链抗体背景

传统意义上血清抗体主要包括IgG1IgG2IgG3IgG4 四种亚型,而驼源主要血清抗体包括IgG1IgG2IgG3三种类型,其中IgG1与传统抗体结构相似,含有2条重链和2条轻链;IgG2IgG3缺少CH1和轻链结构域,因此也被称为重链抗体(heavy Chain Antibody, hcAb),如图1所示:

图1 经典抗体与重链抗体模式结构

(a) 传统抗体 及其Fab/scFv抗体形式 (b) 重链抗体及其VHH抗体形式

重链抗体在羊驼和骆驼血清中的分步是不均衡的,骆驼血清抗体中重链抗体占比约为60-75%,羊驼血清抗体中重链抗体占比约为40-50%。这这种显著的差异导致了构建的骆驼VHH抗体文库具有先天的优势,如表1所示。驼源抗体文库主要是指利用驼源重链抗体的可变区,即VHH区域序列构建的VHH抗体文库,又叫纳米抗体文库。VHH抗体的特点是只含有重链抗体的抗原结合区,如图2所示,氨基酸长度约为110AASDS-PAGE显示分子量约为15kDa(远小于传统抗体150kDa的分子量),具有优秀的稳定性,能够抵抗极端的pH环境。 同时在VHH人源化改造方面,也具有良好的适应性,容易满足Car-T等免疫细胞的改造和分选实验要求。

图2 羊驼重链抗体与VHH抗体模式

骆驼与羊驼VHH抗体文库对比

 

比较项目

骆驼VHH抗体文库

羊驼VHH抗体文库

抗原耐受量

高,多种抗原混合,高剂量免疫

较高,多种抗原混合中等免疫剂量

抗血清滴度

中和抗体效价

较高

抗体亲和力

更容易获得高亲和力抗体

能够获得高亲和力抗体

抗原需求量

4-6mg,纯度>85%

2-3mg,纯度>85%

采血量

一次可采血100ml

一次20ml血液

PBMC细胞量

一般

有效库容

高,免疫库108-109

高,免疫库107-108

免疫代价

较低

小分子抗原反应性

一般

 

驼源抗体文库制备-骆驼VHH抗体库构建服务

卡梅德生物科技(KMD BioscienceTM)能够为客户提供高质量的、骆驼来源的VHH抗体噬菌体展示文库制备服务。我们坚持采用人用疫苗和生物制药的QbD(Quality by Design)设计原则,在充分理解和尊重ICH原则的基础上,设计并制备骆驼VHH抗体噬菌体展示文库,为客户提供全程可追溯的产品追溯体系和文件支撑体系。一个优秀的VHH抗体噬菌体展示文库包含抗原设计,动物免疫,文库构建与筛选等主要环节。

 

---VHH抗体噬菌体展示文库之抗原设计

针对骆驼VHH抗体文库,我们设计了一系列来自于驼源抗体Fc融合表达的人源免疫检查点蛋白。结合我们成熟的Freestyle 293FExpi CHO细胞悬浮表达平台,我们能够为客户在较短的周期内从基因合成,载体构建到克级蛋白的表达,更多的服务需求,请咨询我们的蛋白表达平台。同时,根据我们的实验结果,我们发现小分子靶蛋白直接与人源Fc片段融合后免疫效果要远远好于靶蛋白融合羊驼或骆驼Fc片段后免疫结果(具体实验结果,请联系我们的技术人员)。

 

---VHH抗体噬菌体展示文库之动物免疫

卡梅德生物科技(KMD BioscienceTM)通过与骆驼和羊驼养殖社建立合作,提供未经免疫的,足龄(28-36月龄)的骆驼或羊驼进行抗原免疫,按照标准免疫方法,免疫4-7针。蛋白抗原按照ELISA血清效价>105标准;小分子抗原免疫ELISA血清效价>104标准。

 

---VHH抗体噬菌体展示文库之文库构建与筛选

卡梅德生物科技(KMD BioscienceTM)采用M13噬菌体的pIII蛋白进行VHH抗体(纳米抗体)表面展示。我们的科学家构建了带有Flag6*His tag双标签的噬菌体载体,同时制备出了具有108转染效率的TG1XL1-Blue宿主菌感受态,经过2-3次转染与扩增,能够为客户提供有效库容量为108-109,且包装库容为1013-1016/ml颗粒数的高质量VHH抗体展示文库。通过抗原极限施压筛选方式,经过3轮纳米抗体文库淘筛,即可获得多达20-30株具有高亲和力的噬菌体株。通过简单的IPTG诱导,即可在1-2周内获得大量抗体表达产物,以满足客户FACS,细胞活性测试等研究需求。

 

驼源抗体文库制备---项目流程

 

步骤

服务内容

周期

Step1:动物免疫

1. 准备1只健康、足龄双峰驼(28-36月龄)

2. 免疫骆驼4-7

3. ELISA检测血清效价,效价满足要求后取外周血;若效价不满足要求,则终止试验

6-8

Step2:抗体cDNA制备(客户可以直接提供细胞,从此步开始)

1. 总RNA提取

2. 高保真RT-PCR制备cDNA

3-4

Step3:构建抗体库

1. 引物设计与合成:抗体可变区兼并引物设计、合成

2. 以cDNA为模板,PCR扩增重链抗体基因可变区

3. 噬粒构建与转化:酶切、连接噬菌粒载体,电击转化TG1宿主菌,构建抗体库

4. 鉴定:随机挑选96个克隆,PCR鉴定阳性率

5. 包装,>11013 /ml噬菌体颗粒

Step4: 文库淘筛

(3)

1. 抗原极限施压法进行3轮淘筛

2. 鉴定:随机挑选96个克隆,ELISA效价测定

3. 多达96个阳性克隆进行基因测序,挑选最优的10-15个克隆进行原核表达转化

4. 10-15个阳性克隆表达制备VHH抗体上清

 

 

3-4周

交付

1. 构建与筛选报告,包括测序报告,图片数据;

2. VHH抗体文库2ml,>11013 /ml噬菌体颗粒

3. 10-15个阳性克隆表达制备VHH抗体上清

4. 10-15个阳性克隆表达菌种

注:1.客户提供骆驼外周血淋巴细胞,淋巴结细胞或脾脏细胞(保存在RNA later等溶液中,避免RNA降解,蓝冰运输),从第二步开始制备VHH抗体文库,只需3-4周即可完成。

2. 采用TriZol溶液制备细胞裂解物,干冰运输。

  

驼源抗体文库制备----服务优势

---同时提供免疫库制备服务和天然骆驼/羊驼抗体文库筛选服务

---周期短,约16-20周即可获得高质量的文库和单抗细胞株

---高库容量:有效库容 108 – 109/免疫库;109 – 1011/天然库

---高亲和力抗体制备

---个性化的淘筛策略

---完整的文件追溯体系和QC质控文件

 

驼源抗体文库制备----实验流程

 

如何订购?

 

如果您对我们的服务项目感兴趣,请直接拨打热线电话:+86-022-8216-4980/156-0119-0182或发送邮件至info@kmdbioscience.com